新疆红枣果实不同部位总酚的含量测定

杨璐，努尔比耶，李宏，*（.新疆林业科学院，新疆乌鲁木齐830000；.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830054）



新疆红枣果实不同部位总酚的含量测定

杨璐1，努尔比耶2，李宏1，*
（1.新疆林业科学院，新疆乌鲁木齐830000；2.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830054）

摘要：系统地研究新疆红枣果实不同部位总酚含量的最佳提取和测定方法，为进一步开发利用红枣资源提供有效的测试手段。以没食子酸为标准对照品，研究Folin-Ciocalteu比色法测定新疆红枣果肉和果核的中总酚含量的最适宜条件；以总酚含量为指标，通过L9（34）正交试验考察甲醇浓度、料液比、提取时间和提取次数对总酚提取工艺的影响，确定红枣总酚供试品溶液的提取方法。红枣提取液在Folin-Ciocalteu试剂1.5 mL、25 % Na2CO3溶液2 mL、反应温度30℃、反应时间60min的条件下，测定其760nm处的吸光值，没食子酸浓度在0～100 μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系（R2= 0.998 8）；红枣总酚的最佳提取工艺为50 %的甲醇，料液比1∶10（g/mL），提取时间30 min，提取次数2次。加样回收率为98.79 %，RSD为1.71 %。该提取和测定方法适合于红枣果实总酚含量的测定，利用该方法提取和测定同一产地12个不同品种红枣果核中的总酚含量均明显低于果肉，果肉总酚含量约为果核总酚含量的6倍。

关键词：红枣；总酚；正交试验；单因素试验；Folin-Ciocalteu比色法

红枣（Dried red Jujubes）为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Zizyphusmill）植物的成熟果实枣（Zizyphus jujuba mill）[1]，新疆维吾尔自治区的东疆、南疆地区利用其独特的自然条件，把发展大枣产业作为振兴当地经济的支柱产业和枣区农民增收的主要来源。目前普遍认为新疆产枣果的品质优于内地。较多的研究均认为新疆枣以其果实饱满、肉质细腻、含糖量高、口味浓郁、营养丰富为其他红枣所不及，枣果品质远远超过其原产地[2-6]。

红枣中含有丰富的总酚类化合物，总酚是一类广泛存在于植物体内的多羟基酚类化合物的总称，具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、防晒美白、护肝益肾、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病以及抑菌消炎抗病毒等多种生理功能[7]。为合理开发利用新疆红枣中酚类化合物资源，本研究采用Folin-Ciocalteu比色法考察新疆主产的12个品种红枣果肉和果核中总酚的含量，期望为新疆红枣的质量控制和开发利用提供理论参考。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

于新疆林业科学院佳木试验站采集新疆主产的12个红枣品种（骏枣、灰枣、赞皇大枣、新郑大枣、金昌1号、哈密大枣、圆脆红枣、新疆小圆枣、新疆长圆枣、壶瓶枣、冬枣、梨枣）作为供试材料。采集的样品来自同一个果园、同一年成熟期、统一制干的红枣果实。

没食子酸标准品、硫酸锂：上海山浦化工有限公司；无水碳酸钠：天津市登科化学试剂有限公司；钼酸钠：金堆城钼业股份有限公司化学分公司；钨酸钠、磷酸、甲醇、乙醇、丙酮：天津市致远化学试剂有限公司；浓盐酸：西安化学试剂厂。

SW23水浴锅：德国优莱博公司；UV-2600紫外光谱仪：日本岛津公司；TP-2102电子天平：德国赛多利斯集团。

1.2样品处理

1.2.1 Folin-Cioealteu试剂的配制[8]

精确称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠，加入140 mL超纯水，完全溶解后，加入10mL85%磷酸溶液和20mL浓盐酸，倒入带回流装置的圆底烧瓶中，充分混匀，水浴回流2 h，冷却后，再加入30 g硫酸锂和15 mL 30 %的双氧水，加热沸腾至溶液呈亮黄色（约15 min）。自然冷却后至于250 mL棕色容量瓶中，用蒸馏水定容，置于棕色试剂瓶内，保存在冰箱中。

1.2.2对照品溶液的配制

精密称取10 mg的没食子酸标准品，置于100 mL容量瓶用超纯水溶解并稀释至刻度，得质量浓度为0.1 mg/mL的标准溶液。

1.2.3供试品溶液的制备

每个品种均随机选取无病虫、无机械伤害的干制红枣若干，处理前先将果肉（带果皮）与果核分离。分别取果肉和果核样品各100 g放入冷冻粉碎机中粉碎。粉碎后放入-80℃超低温冰箱中备用。精密称取红枣备用样品1 g，至于具塞锥形瓶中，加入10 mL甲醇溶液（50 %），超声辅助提取30 min，提取1次，转入离心管中在4 500 r/min离心5 min，取上清液2 mL加水稀释至10 mL，即得供试品溶液。

1.2.4样品测定方法

用移液器精密吸取供试品溶液2 mL于10 mL容量瓶中，再加入1.5 mL Folin- Ciocalteu试剂，摇匀，5 min后加入2 mL 25 % Na2CO3溶液，加水稀释至刻度，摇匀，30℃水浴60 min，取出冷却后在760 nm下比色。1.3工作曲线的建立

采用改进后的方法，取6支试管，分别精确吸取不同体积的没食子酸标准溶液于10 mL容量瓶中，加入1.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，摇匀，5 min后加入2 mL 25 % Na2CO3溶液，加水稀释至刻度，摇匀，配置成浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg/mL的标准液，30℃水浴60 min，按选定方法测定吸光度，并根据各标准溶液的浓度及相应的吸光度绘制工作曲线，见图1。

图1样品总酚含量测定标准曲线Fig.1 The standard curve of sample determination

结果表明，没食子酸在浓度为0~100 μg/mL内与其吸光值有良好的线性关系，在此范围内线性回归方程为y =0.017 0x+0.014 7，相关系数仍R2=0.998 8。

2结果与分析

由于不同因素对总酚提取和测定的结果产生的影响不同，因此在Folin-Ciocalteu比色法的基础上，对主要的影响条件进行了改进，对红枣果实总酚超声辅助提取工艺进行了优化。

2.1红枣中总酚含量的测定方法的优化

2.1.1检测波长的确定

准确移取浓度为40 μg/mL没食子酸标准溶液1 mL，进行显色反应，用紫外可见分光光度计在500nm~ 850 nm波长范围进行扫描，以确定最大吸收波长为测定波长。没食子酸标准溶液经显色反应后的吸收光谱图见图2。

其吸收曲线显示，在760 nm波长处体系有最大吸收峰，故试验选择760 nm为测量波长。

2.1.2 Na2CO3溶液用量的确定

酚类化合物需要在碱性条件下将钨钼酸还原显色，体系中的Na2CO3溶液是显色反应的支持介质[9]。精密吸取5份浓度为40 μg/mL的没食子酸标准溶液1 mL，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 25 %的Na2CO3溶液，按试验方法显色后，以相应的试剂空白作参比，在760 nm波长处测定吸光度，以确定碱性溶液用量对比色效果的影响，选择最佳的Na2CO3用量。Na2CO3用量对测定结果的影响见图3。

图2没食子酸经Folin-Ciocalteu试剂显色后的吸收光谱Fig.2 Absorption spectra of gallic acid reacted with Folin-Ciocalteu reagent

图3 Na2CO3用量对测定结果的影响Fig.3 Effect of dosage of Na2CO3on absorbency

当Na2CO3的用量为2 mL时有最大吸光值。由此可见Na2CO3溶液的加入量会影响体系的比色效果，显色反应对Na2CO3溶液的用量具有依赖性。当加入碱的浓度和加入量为2 mL 25 %的Na2CO3时体系显色反应较为完全。

2.1.3 Folin试剂用量的确定

Folin-Ciocalteu试剂的用量以及它与Na2CO3溶液的比例也会影响体系的比色效果。精密吸取6份浓度为40 μg/mL的没食子酸标准溶液各1 mL，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL Folin试剂，按试验方法显色后，以相应的试剂空白作参比，在760 nm波长处测定吸光度，以确定最佳的显色剂用量。Folin试剂用量对测定结果的影响见图4。

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显色剂的用量对比色效果具有一定的影响。当显色剂浓度较低时吸光度较低，随着显色剂加入量的增加，比色体系的吸光值也随之增加，并且吸光值的增加趋势比较明显。当显色剂的添加量超过1.5 mL后，比色体系的吸光值逐渐降低，因此比色体系中显色剂的添加量定为1.5 mL较合适。

图4 Folin试剂用量对测定结果的影响Fig.4 Effect of dosage of Folin-Ciocalteu on absorbency

2.1.4最佳水浴温度和时间的确定

显色反应温度对显色效果有一定的影响，过低或者过高都不利于总酚的显色。精密吸取5份40 μg/mL的没食子酸标准溶液1 mL，按照试验方法显色后，分别在20、30、50、70、90℃水浴加热30 min，冷却后测量吸光度值，以确定反应温度对比色效果的影响。水浴温度和时间对测定结果的影响见图5。

图5吸光值随反应温度的变化Fig.5 The Absorbance at different reaction temperature

随着水浴温度的升高，显色反应速度加快，吸光度也逐渐增大，在30℃时吸光度达到最大值，随着温度高于30℃条件下，吸光度逐渐降低。这表明显色反应生成的蓝色物质在高温下不稳定，所以本试验确定显色反应温度为30℃。

酚类化合物与显色剂反应需要一个过程，时间过短显色反应不完全从而影响显色结果。精密吸取3份40 μg/mL的没食子酸标准溶液1 mL，按照试验方法显色后，在30℃分别水浴加热5、10、20、30、40、50、60、80、100、120 min，冷却后测量吸光度值，以确定比色体系反应完全所需要的时间。吸光值随反应温度的变化结果见图6。

在最佳反应温度30℃下，总酚在50 min后可充分显色，之后随着时间的延长吸光度值基本保持稳定，因此选择60 min。

2.2红枣果实中总酚提取方法的优化

图6吸光值随反应时间的变化Fig.6 The Absorbances at different reaction time

表1正交试验水平编码Table 1 Levels of the factors in orthogonal experiment

釆用正交试验对红枣总酚的提取条件进行优化，正交试验结果如表2所示。总酚提取工艺方差分析结果见表3。

表2 L9（34）正交试验结果Table 2 The result of orthogonal experiment L9（34）

表3总酚提取工艺方差分析Table 3 The total phenol extraction process of analysis of variance

从极差分析中可以看出，各因素对红枣总酚得率的影响主次顺序为：甲醇体积分数（A）>料液比（B）>提取次数（D）>提取时间（C）。极值最小的提取时间（C）因素为误差项进行方差分析，甲醇体积分数（A）因素影响显著（P<0.01），其他因素则无显著性影响。最佳提取工艺组合为：A1B2C2D2，即甲醇浓度50 %，提取时间为30 min，料液比1∶10（g/mL），提取次数2次。在该工艺条件下，红枣总酚的得率最高。

2.3稳定性试验

取红枣果肉样品，按正交试验选定的最优提取方法制备总酚样品溶液，按单因素试验选定的最优检测方法进行总酚含量的测定，分别于显色反应（60 min）稳定后每10 min测定一次吸光度。稳定性测定结果如图7所示。

图7红枣总酚稳定性Fig.7 Stability of total phenolic contents in Dried Jujubes samples

结果表明：在0~2 h内测定值仍比较稳定，60 min后吸光度略有下降，其RSD为0.578 %。

2.4重复性

取同一份红枣果肉样品，按选定方法制备样品溶液，样品平行处理6次，测定吸光度，计算吸光度值A的相对标准偏差，RSD为1.32 %，表明该试验方法的重复性良好。

2.5加样回收

精密称取6份果肉样品各0.3 g，分成3组，各组分别加入对照品溶液100 μg，按试验方法测定吸光度，并计算加样回收率和相对标准偏差，结果如表4所示。

表4回收率试验结果Table 4 The results of recovery experiment

平均回收率为98.79 %，RSD为1.71 %，符合方法要求的回收率，表明该红枣总酚提取方法和测定方法可用于总酚含量的测定。

2.6总酚含量测定结果

分别对12个不同品种红枣果肉和果核中总酚含量进行测定，结果见表5。

表5不同品种红枣样中总酚含量Table 5 Total phenolic contents in different Dried Jujubes cultivars

由表5可以看出，红枣不同品种果实果肉中的平均总酚含量为1378.05mg/100g，变幅为751.25mg/100 g。其中哈密大枣中含量最高是1837.48 mg/100 g，新疆小圆枣的含量最低为1 086.23 mg/100 g。

红枣不同品种果核中的平均总酚含量为243.77 mg/ 100 g，变幅为91.20 mg/100 g。哈密大枣中含量最高是296.15 mg/100 g，金昌1号的总酚含量最低为204.95 mg/100 g。经方差分析可知同一个品种红枣果肉和的果核中总酚含量差异显著（P<0.05），果肉中总酚含量约为果核的6倍。

3　结论

由于不同研究文献中Folin-Ciocalteu比色法的比色条件有一定的差异，对于不同的样品材料会产生比较大的误差[9]。本文采用单因素试验对Folin-Ciocalteu比色法对测定红枣总酚含量进行系统的研究，以没食子酸作为标准品，没食子酸在浓度为0~100 μg/mL内与其吸光值有良好的线性关系（r = 0.998 8）；检测波长经试验测定为760 nm，红枣提取液在Folin-Ciocalteu试剂1.5 mL、25 % Na2CO3溶液2.0 mL、反应温度30℃、反应时间60 min的条件下，测定其760 nm处的吸光值；采用正交试验对红枣多分的溶剂提取工艺进行了研究，确定了最佳提取工艺条件为：甲醇浓度50 %，提取时间30 min，料液比1∶10（g/mL），提取次数2次。平均回收率为98.79 %，RSD为1.71 %。该法是检测红枣中总酚含量的可靠方法。

测定加过表明：此次涉及的12个红枣品种总酚较高，但不同品种间含量差异显著，果肉中总酚含量为1 837.48 mg/100 g~1 086.23 mg/100 g，果核中总酚含量为296.15 mg/100 g~204.95 mg/100 g。朱锐等的研究表明，同一品种红枣间因栽培环境和管理措施不同枣果中的营养成分存在差异[6]。本研究中12个供试品红枣品种均采自同一样地，栽培环境和管理措施一致，说明不同品种红枣间的总酚含量及抗氧化活性存在差异主要与红枣的基因型有关。

参考文献：

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Determination of Total Polyphenols in Different Parts of Jujubae Fruetus Growing in Xinjiang

YANG Lu1，NUERBIYE2，LI Hong1，*
（1.Xinjiang Academy of Forestry，Urumqi 830000，Xinjiang，China；2.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Abstract：The study was to investigate an optimal Folin -Ciocalteu colorimetric method to determine polyphenols in Dried Jujubes systematically，and to provide an effective way to estimate the polyphenols for the value of Dried Jujubes. Gallic acid was used as a standard substance to determine total polyphenol contents in different parts of Dried Jujubes growing in Xinjiang by Folin-Ciocaheu Colorimetry. With the content of total phenols as index，effects of solvent concentration，solid-liquid ratio extraction time and times on extraction technology of total phenols were investigated by L9（34）orthogonal test，in order to define preparation method of the test solution for determination. The results showed that when the concentration of Folin- Ciocalteu reagent was 1.5 mL and the concentration of 25 %Na2CO3was 2 mL，reaction 60 min in 30℃，there was a good linearity relationship between absorption value with the concentration from 0-100 μg/mL in 760 nm（R2= 0.998 8））. The total phenol in Dried Jujubes in 1∶10（g/mL）to 50 % methanol for 30 min would with two times be preferably extracted.Theaveragespikedrecoverywas98.79%，witha RSDof1.71%．Theextractionanddeterminationmethods were suitable for the determination of total phenol in Jujubae Fruetus samples．The same total phenol contents differences between the pulp and core is larger，pulp total phenol content is about 6 times of core of the fruit.

Key words：Jujubae Fruetus；total polyphenols；orthogonal test；single factor test；Folin-Ciocalteu colorimetry

收稿日期：2014-08-26

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.036

*通信作者：李宏（1962—），男，研究员，博士，主要从事林果栽培和综合利用研究。

作者简介：杨璐（1985—），女（汉），硕士，主要从事植物资源化学与生物活性物质研究。

基金项目：特色林果重大病虫持续高效绿色防控技术研究（项目编号：201130102-3）