丹参寒热药性的实验评价

王　征，刘建利，王翠玲，唐志书，宋中兴

(1.陕西中医学院 陕西省中药资源产业化协同创新中心，

陕西省中药基础与新药研究重点实验室 陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712083;

2.西北大学生命科学学院 西部资源与现代生物技术教育部重点实验室，西安 710069)



丹参寒热药性的实验评价

王征1，刘建利2，王翠玲2，唐志书1，宋中兴1

(1.陕西中医学院 陕西省中药资源产业化协同创新中心，

陕西省中药基础与新药研究重点实验室 陕西省风湿与肿瘤类中药制剂工程技术研究中心，陕西 咸阳 712083;

2.西北大学生命科学学院 西部资源与现代生物技术教育部重点实验室，西安 710069)

摘要：目的通过前期建立的中药寒热药性的细胞评价方法评价中药丹参的寒热药性。方法用噻唑蓝(MTT)比色法考察丹参对SGC-7901细胞体外增殖的影响，倒置显微镜观察丹参对细胞形态特征的影响，台盼蓝染色法分析丹参的细胞毒作用。结果丹参在所选浓度5～800 μg/mL内对SGC-7901细胞增殖的影响表现为抑制。形态学观察表明丹参能使细胞密度减小，细胞固缩变圆，颗粒感增加。台盼蓝染色表明丹参对这两种细胞没有细胞毒作用。结论丹参性寒，与《本经》《本草纲目》《中药学》所述一致，对所用细胞没有细胞毒作用。

关键词：丹参;MTT法;SGC-7901细胞;台盼蓝染色

丹参始载于《本经》，为唇形科多年生草本植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根茎[1]。其性味《本经》和《本草纲目》记载为苦，微寒。《本草经疏》记载为苦，微温。《中药学》记载为性味苦，微寒[2]。以上文献研究表明在传统临床用药中对丹参寒热药性的认识存在较大的分歧。因此通过科学的实验方法对丹参的寒热药性进行评价就尤为必要。本实验室在前期的工作中，基于细胞模型建立了评价中药寒热药性的方法[3-5]。该方法基于温热药可以使生物体的生理功能亢奋，而寒凉药则表现为抑制[6]。这在动物模型上也有体现，如用寒药造模可以使动物的体温降低，中枢兴奋抑制以及代谢减慢，而热药的作用则相反[7-9]。由此可以推测，寒热药对生物体最小的组成单位——细胞也应该有一定的影响，即寒药会抑制细胞的生长增殖，而热药则会表现出促进作用。在前期的工作中已经验证了这一想法，并且已经建立了评价中药寒热药性的简便方法。本文把该方法应用于古今寒热药性有争议的丹参，希望用实验方法解决争议。

1材料

1.1细胞株人胃癌细胞株SGC-7901，由第四军医大学提供。

1.2实验仪器电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)、灭菌锅(四川新德医疗器械)、μQuant 酶标仪(美国Bio-Tek)、W201恒温水浴摇床(上海申生科技有限公司)、CO2培养箱(Sanyo公司)、96孔细胞培养板、倒置光学显微镜(重庆光学仪器厂)、5424R高速离心机(德国Eppendorf)、超净工作台( 苏州安泰)。

1.3药品与试剂丹参(购自西安市藻露堂医药超市,由西北大学生命科学学院房敏峰高级工程师鉴定为正品药材)、MTT、DMSO、自配PBS(磷酸缓冲液)、0.25%胰蛋白酶(西安舟鼎国生物技术有限公司)、台盼蓝染料(西安沃尔森生物技术有限公司)、Hyclone 改良型RPMI-1640培养液(赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司)、四季青无支原体胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。

2方法

2.1受试药品溶液的制备称取丹参20 g,微火煎煮30 min，重复3次,合并水煎液,浓缩,定容至20 mL,质量浓度为1 g/mL。将药液在10 000 r/min，离心30 min,取上清液用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,最后用无菌水稀释至10 mg/mL,备用。

2.2细胞培养 将SGC-7901细胞用0.25%的胰酶消化，传代于含有10%胎牛血清的培养基中，静置于二氧化碳培养箱中进行培养。

2.3MTT试验取对数生长期的SGC-7901细胞，将细胞消化，接种于96孔细胞板上，然后加入200 μL RPMI-1640培养基，在二氧化碳培养箱中培养24 h后更换培养基。实验设8个浓度梯度，分别为5、10、20、50、100、200、400、800 μg/mL，同时设置对照组，每组3个重复孔。加药完毕后继续在二氧化碳培养箱中培养48 h，更换培养基，然后每孔加入新配置的噻唑蓝溶液(5 g/L)20 μL，继续培养4 h。吸弃培养液,每孔加入150 μL DMSO,震荡10 min(60次/min)后, 用酶联免疫标定仪测定490 nm处吸光度(A)值。按下列公式计算细胞抑制率。抑制率为正值表示对细胞生长增殖有抑制作用,负值表示对细胞有促增殖作用[10]。实验重复3 次。

细胞抑制率=(1-实验组A 值/ 对照组A 值)×100%

2.4台盼蓝染色实验操作参照上步MTT实验，将细胞接种于96孔板后培养48 h，然后更换培养基，加入0.4%的台盼蓝染液20 μL,5 min后用显微镜观察。

3结果

3.1MTT法检测用MTT法分别检测丹参在5～800浓度范围内SGC-7901细胞体外增殖的影响，所得实验数据，见表1。

±s，n=3)

注：与空白对照组比较，# <0.05，##P<0.01

由表1可以看出，在5～800 μg/mL浓度范围内，丹参对SGC-7901细胞的增殖都表现为抑制作用，为了能更加直观的看出丹参对SGC-7901细胞的抑制率随浓度变化的趋势，以抑制率对浓度作图，所得曲线，见图1。

图1　丹参对SGC-7901细胞增殖抑制率的变化

从图1中可以直观的看到丹参对SGC-7901细胞的增殖整体上表现为抑制，其抑制率随浓度的增大而增大。丹参对SGC-7901细胞增殖的最大抑制率所对应的浓度为800 μg/mL，最低抑制率对应为5 μg/mL。根据笔者以前所得实验结果判断，丹参性寒。此与《本经》《本草纲目》和《中药学》所述一致，并为这3种著作所述提供了有力的实验证据支撑。

3.2丹参对SGC-7901细胞形态的影响对照组与加药组在倒置显微镜下观察拍照，见图2。

图2　丹参煎液对SGC-7901细胞形态的影响

笔者选取400 μg/mL细胞照片与空白对照组照片比较。由图中可以清楚的看到与空白对照组相比较，丹参400 μg/mL作用48 h后，与空白对照组比，加药组的细胞密度明显降低，没有对照组致密，细胞形态也有所变化。正常的SGC-7901细胞其细胞在倒置显微镜下呈不规则的多边形，核膜、核仁轮廓明显，细胞致密、延展、扁平。在丹参400 μg/mL作用48 h后细胞相比于对照组，SGC-7901细胞变圆，细胞颗粒感增加，部分细胞在加药48 h后脱落，培养基中有悬浮的细胞残骸。

3.3台盼蓝染色经台盼蓝染色实验发现处理后未见有着色细胞，说明丹参在5～800 μg/mL浓度范围内对SGC-7901细胞没有细胞毒作用，是通过抑制细胞的生长来影响细胞的增殖。

4结论

丹参作为传统的活血调经中药，对于其寒热药性文献记载不一。《本草经疏》言其苦，微温，而《中药学》《本经》以及《本草纲目》都记载为寒性。中药的寒热药性是在临床用药的过程中由临床工作者根据自己的经验总结出来的，由于个体因素的差异，因此对一些中药的寒热药性无法形成统一的认识[11-12]。本文根据前期建立的评价中药寒热药性的方法对丹参的寒热药性进行了评价。在5～800 μg/mL浓度范围内丹参对SGC-7901细胞的增殖表现出抑制的作用。且经过台盼蓝染色观察到丹参对SGC-7901细胞不产生细胞毒性。根据寒药可能会抑制细胞生长、代谢以及增殖，而热药会表现为促进，可以得出丹参性寒。这一结论与《本经》《本草纲目》和《中药学》所载一致，在阐明丹参寒热药性的同时也为这三部著作的观点提供了科学的实验证据支撑。

参考文献：

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[4]王征,张宁,刘建利.采用两种细胞模型评价野菊花的寒热属性[J].中草药,2012,43(8):1586-1589.

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[12]年莉, 李慧萍,王亚萍,等. 对方剂配规律研究的几点认识[J].天津中医药大学学报,2013,32(3):129-131.

Evaluating cold and hot characteristic ofSalviamiltiorrhizaBge. by experimental method

WANG Zheng1,LIU Jianli2,WANG Cuiling2,TANG Zhishu1,SONG Zhongxing1

(1.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization,Shaanxi province key laboratory of new drugs and Chinese medicine foundation research,Shaanxi rheumatism and tumor center of TCM engineering technology research,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xian Yang 712083,Shaanxi Province,China;2.Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China,Ministry of Education,College of Life Science,Northwest University,Xi’an 710069,China)

Abstract：ObjectiveTo evaluate the cold and hot characteristic ofSalvia miltiorrhiza Bge.by the method we have set up.MethodsMTT assay was used to investigate the effect ofSalvia miltiorrhiza Bge.on the growth of SGC-7901 in vitro.Morphological changes of SGC-7901 treated withSalvia miltiorrhiza Bge.were observed through invert microscope.Trypan-blue staining was used to analyze the cytotoxicity ofSalvia miltiorrhiza Bge.ResultsSalvia miltiorrhiza Bge.can inhibit the growth and proliferation of SGC-7901 in the concentration range of 5-800 μg/mL.Morphological observation showed Salvia miltiorrhiza Bge.in the concentration range we have chosen could decrease the density of SGC-7901 and condense the cell.Trypan-blue staining showedSalvia miltiorrhiza Bge.had no cytotoxicity on SGC-7901.ConclusionThe results show thatSalvia miltiorrhiza Bge.is a cold drug and have no cytotoxicity.

Keywords：Salvia miltiorrhiza Bge.;MTT assay;SGC-7901;rypan-blue staining

(收稿日期:2015-09-15)

文章编号：2095-6258(2016)01-0037-03

中图分类号：R282.71

文献标志码：A

作者简介：王征(1986-)，男，中药学博士，讲师，主要从事中药活性成分的仿生合成与结构修饰研究。

基金项目：国家自然科学基金(20872118);教育部博士点基金(20070697012);陕西省重大科技专项(2008ZDKG-67);陕西省重点实验室基金(08JZ74,02JS15)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.01.011