种子发育和萌发过程的蛋白质组学研究

李 佳， 陆秀君， 梅 梅，， 张晓林， 马 跃

（1.沈阳农业大学林学院， 辽宁 沈阳110866； 2.沈阳农业大学园艺学院， 辽宁 沈阳110866）

种子是植物传播的主要形式和繁殖器官，它贮藏足够养分以供幼苗生长成为自养体，是子代植株形成的开端［1］。蛋白质是生命现象的直接体现者，也是生理功能的最终执行者，同时它不仅是种子养料的提供者，也是种子内部生化反应和代谢过程的调控者，因此，在种子的形成、发育、萌发直至成苗的过程中，蛋白质都发挥着极其重要的作用。随着拟南芥、水稻等高等植物基因组计划的完成，生命科学的研究已经进入到功能基因组时代。目前，功能基因组学的研究大多是从mRNA水平考虑的，细胞中mRNA的水平能反映蛋白质的表达水平。从mRNA到蛋白质，包括3个水平的调控：转录后水平调控、翻译水平调控和翻译后水平调控。然而，mRNA丰度与蛋白质丰度并不呈正相关，尤其对于一些低丰度蛋白来说，相关性更差［2－3］。一个基因对应的可能不是一种蛋白质而是几种甚至是数十种。因此完全有必要从蛋白质水平上去研究基因的功能。种子生物学作为植物学重要分支，随着高通量分离鉴定技术的发展，特别是种子蛋白质组门户网站 （SPWP；http：／／www.seed－proteome.com／）的 建立［4］，蛋白质组学已成为基因功能分析的有利工具，越来越多地应用于种子发育、休眠、破眠以及萌发等方面的研究。

1 种子发育过程中的蛋白质组研究

高等植物种子的发育可以分为3个时期：胚胎发生期、种子形成期和成熟休止期；主要经历组织分化、储藏物质积累和成熟干燥3个阶段。在组织分化阶段，受精卵细胞经过快速的细胞分裂，发育成不同的种子组织；随后，小细胞分裂、细胞膨胀、种子储备物沉积（通常为蛋白质、脂质或碳水化合物）；最后，成熟干燥时种子发育减缓，干物质停止积累，使种子处于新陈代谢静止的阶段［5］。种子发育的不同时期，不同组织的蛋白质表达既存在差异性，也具有一定的相似性，其中一些蛋白质在整个发育过程中都发挥着作用，并在某一时期大量积累来影响种子的形成与发育［6］。

1.1 组织分化阶段的关键蛋白

种子从受精开始到胚形态初步建成的过程中不仅进行着贮藏物质的合成与分解，还伴随着强烈的细胞分裂分化过程和有关细胞骨架、细胞壁形成蛋白活动的增加。有研究发现，大豆（Glycine max）种子发育过程中有2种蛋白质参与了细胞增大过程［7］。其中的一种蛋白 Skp 1（S－phase kinase－associated－protein 1）在种子发育15d时出现，随着发育的进行含量逐渐增加。Skp 1影响细胞分裂以及细胞扩大与伸长，它的表达模式与其在胚胎发生和幼苗发育过程所起的作用相一致［8］；另一种蛋白是肌动蛋白，它是细胞骨架的基本组成成分，参与胞质流动、细胞分化、细胞器运动、细胞伸长、顶点生长以及细胞极性建成等过程［9］。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）突变体中发现一种肌动蛋白异构体可能对细胞伸长有一定的作用，因为这种蛋白的表达和下胚轴伸长过程密切相关［10］，而在拟南芥种子萌发过程中发现了肌动蛋白7（ACT 7），从而进一步证实了上述结论［11］。狭叶南洋杉种子胚胎形成的整个过程中几丁质酶（几丁质酶Ⅳ除外）活性一直很高，阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）在胚胎形成的前期显著表达，主要促进细胞的分裂与分化，而在种子后熟期表达量下降［12］。

1.2 与胚和胚乳发育相关的蛋白

种子发育期间，特异基因表达的特异蛋白与组织的形态建成、细胞的不同功能或机体的生理生化变化密切相关，因此研究该过程的特异蛋白质对认识胚分化发育的分子本质有重要意义。在马尾松（Pinus massoniana L.）种胚早期发育过程，调控碳代谢的蛋白在卵裂期和柱状胚胎期显著上调表达，为胚的发育提供糖类和能量；eIF 5A蛋白参与细胞程序性死亡和mRNAs的选择性表达，对次生胚的消亡和胚柄的退化起着关键性作用；还有一些蛋白在调控蛋白质的折叠、氮代谢和防御反应过程发挥作用［13］。杉木（Cunninghamia lanceolata Lamb.Hook）早期胚发育过程有136个蛋白质出现不同的动力学反应，其中有71个蛋白质参与细胞程序性死亡和染色质修饰，推测它们可能在决定合子数量、调控胚胎模式和形状重构方面发挥作用；而另外一些蛋白则与碳代谢、蛋氨酸代谢、能量代谢、蛋白质合成以及胚发育等生理活动密切相关［14］。在水稻（Oryza sativa L.）种胚的生长、分化、成熟、脱水及休眠五个阶段，共找到275个差异蛋白，统计分析发现，胚发育早期高丰度蛋白主要参与代谢、蛋白合成与降解及其他细胞学功能，而发育晚期的高表达量蛋白主要与胚的脱水及休眠有关［15］。巴西松（Araucaria angustifolia （Bert）O.Ktze）合子胚发育早期高度积累的蛋白质（如α－木糖苷酶）主要调控氧化应激活动，而胚发育后期贮藏蛋白（如豌豆球样蛋白）以及与呼吸作用相关的蛋白（如磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸异构酶和异柠檬酸脱氢酶）逐渐积累［16］。狭叶南洋杉（Araucaria angustifolia）种子发育过程中，鱼雷胚期共检测到约230个蛋白，成熟胚期约340个蛋白，这是因为种子发育直至成熟过程贮藏蛋白和亲水性的胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）在不断生成，从而保护组织细胞在脱水过程免受伤害［17］。

胚乳是由受精极核反复分裂而发育的营养组织，其发育过程涉及的蛋白质不仅参与细胞的代谢与贮藏物质的合成，而且还能作为贮藏物质为发育或萌发中的胚提供养分［18］。在玉米（Zea mays L.）中鉴定了632个蛋白，初步建立了玉米胚乳蛋白质表达谱：玉米胚乳发育早期，参与细胞分裂分化、细胞骨架和细胞壁沉积等结构建成，呼吸代谢和抗活性氧的蛋白量最高；胚乳淀粉开始积累时，与分解糖类相关的酶丰度显著提高；在胚乳积累贮藏物质晚期，正磷酸丙酮酸二激酶在维持淀粉和蛋白质平衡中发挥重要作用［19－20］。在小麦（Triticum aestivumL.）胚乳发育蛋白质变化的研究中，鉴定了250多个蛋白质，共涉及ATP转换、碳水化合物代谢、细胞分裂等13个生化过程。在发育早期（开花后10d）胚乳中蛋白质主要参与碳水化合物代谢、转录或翻译、蛋白质合成或组装，之后是氮代谢、蛋白质周转代谢、细胞骨架、细胞分裂、信号转导和脂质代谢，在发育后期（开花后36d）蛋白质主要的功能为防御和贮藏［21］。Xu等［11］发现，在水稻胚乳细胞淀粉粒包装完成时伴随着活性氧的产生，之后胚乳细胞进入程序性死亡（PCD）过程，其中近70%的差异表达蛋白质是氧化还原反应的靶蛋白，它们参与淀粉合成、糖异生以及其他大分子分解代谢过程。由此推测氧化还原稳态可能是协调淀粉合成、PCD以及PCD过程中细胞碳骨架流向淀粉合成的重要因子之一。Liu等［23］对麻疯树（Jatropha curcas）种子在发育过程中脂质积累的六个阶段进行了分析，共鉴定出104个差异蛋白，这些蛋白共分属10个功能类别。其中与能源和新陈代谢有关的蛋白积累的最多，并且这些蛋白参与碳通量脂肪的积累［22］。

1.3 成熟干燥阶段的关键蛋白

成熟干燥是大多数种子完成发育的最后一步，大部分种子经历脱水干燥后才具有发芽能力。在植物种子胚胎发育后期，LEA是一类庞大而高度多样化的蛋白，主要在植物的抗旱性和抗寒性方面发挥作用［23］。根据氨基酸序列的同源性及一些特殊的基元序列，LEA蛋白可分为6组：LEA－Ⅰ蛋白为水分结合蛋白，防止细胞在干旱胁迫时水分流失，同时也在高等植物的胚胎发育和渗透压防护方面起作用；LEA－Ⅱ蛋白在代谢中起分子伴侣和亲水性溶质的作用，在水分胁迫时可以防止蛋白聚集，稳定和保护蛋白质的结构及功能；LEA－Ⅲ蛋白可以避免干旱胁迫时细胞内高浓度离子的累积所引起的损伤，也可以保护细胞中的酶免受干燥带来的伤害，同时也可防止组织过度脱水，提高对盐的耐受性；LEA－Ⅳ蛋白起束缚离子的作用，在种子干燥脱水时，保持膜的稳定性；LEA－Ⅴ蛋白推测可能与种子成熟耐脱水性有关；LEA－Ⅵ蛋白研究较少，其中CaLEA 6蛋白在高盐和脱水引起的水分亏损中起保护作用［24－25］。脱水素（DHNs）是一类具有亲水性，耐热性的应激蛋白，并带有大量电荷的氨基酸，属于LEA－Ⅱ蛋白家族，其功能为保护细胞免受来自于干燥胁迫的脱水损伤［26］。它在成熟种子中含量很高，但是随着种子萌发逐渐减少［27］。小热休克蛋白（sHSPs）在种子成熟的胚胎中被发现，sHSPs与LEA蛋白的伴侣蛋白类似，可参与分子修饰和适当的蛋白质折叠，从而通过维护适当的结构完整性来保护细胞膜和相关蛋白以防种子脱水［28］。在水稻种子中鉴定出LEA，sHSPs，它们在初期积累，在干燥阶段处于较高的水平，表明这些蛋白起到了抗旱的作用［29］。

2 种子休眠相关的蛋白质组研究

种子休眠性状的表达能够体现一系列基因表达的情况，与许多复杂的生理生化反应和信号分子转导等过程密切相关，利用蛋白质组学技术可以检测种子休眠过程中蛋白质积累的同步变化以及时间模式。Lee等对新鲜采集的台湾山樱桃（Prunus campanulatal Maxim）种子进行高低交替变温层积处理，利用2－DE技术发现种子休眠解除前后有71种蛋白丰度发生明显变化，经MS鉴定和序列比对得到DHNs、樱桃甙Ⅰ前体、樱桃甙Ⅱ前体以及樱桃甙Ⅱ［30］。这是首篇有关木本植物打破休眠的蛋白质组学分析报道。兰海等［32］对强休眠玉米自交系08－641分别进行休眠和破除休眠的种子的蛋白质组学差异表达分析，结果检测出的差异蛋白主要有球蛋白、LEA、豆球蛋白等贮藏物蛋白质，蛋白酶体、山梨醇脱氢酶等参与物质代谢的蛋白质，热激蛋白（HPS）等参与蛋白质结构、细胞功能调控的蛋白质。推测这些蛋白的过量表达或缺失抑制了种子的正常萌发［31］。种子处于休眠状态时，LEA表达量通常很高。HPS作为分子伴侣参加多种细胞生理活动，它的表达不仅受高温热激诱导还受发育调节。研究发现HPS在干燥成熟的种子中含量很高，但是随着种子的萌发含量逐渐下降直至消失。这表明HPS是种子保持休眠所必须的蛋白。从种子休眠的本质来看，它是植物在长期发育进程中获得的一种适应环境变化以保持生存与进化的生物学特性。由此可以推断，种子对环境胁迫的适应程度与休眠水平是一致的。

目前解释种子休眠的主要假说之一是植物激素的调控作用。ABA是通过合成和代谢过程中不同酶基因的表达来影响ABA的水平，而GAs在种子休眠解除中的作用一直备受争议，虽然GAs的积累与解除休眠有关，但GAs的单独作用并不刺激所有物种［32］。近几年通过调控ABA／GAs的阈值范围解除种子休眠，ABA和GA相互抑制对方的合成与分解代谢基因，两者均可调控а－淀粉酶基因的转录。近年来发现，AUX参与调控种子的休眠，其要调控胚根突出，AUX信号与ABA信号存在交叉，AUX通过其响应蛋白ARF 10／16间接调控ABA信号通路中 ABI 3的稳定性来调控拟南芥种子休眠［33］。在拟南芥种子中发现，外施ABA后能够触发种子内部蛋白水解。甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）、1，6－果糖二磷酸醛缩酶、延伸因子EF－1和2，α－微管蛋白、分子量约70kD的热休克蛋白（HSP 70）、脱水素、天冬氨酸转氨酶以及核糖体蛋白与拟南芥种子休眠解除密切相关［34］。利用35S－甲硫氨酸标记表明，外源ABA不会抑制蛋白质的重新合成。此外，吸胀的休眠种子中有新合成的蛋白质，说明抑制种子萌发的原因不是因为蛋白质翻译的停滞［35］。用水、ABA和GAs分别对欧洲山毛榉（Fagus sylvatica L.）眠休种子进行处理，用水处理的种子破眠蛋白多参与能量代谢和蛋白质定位，在ABA处理下的种子破眠蛋白大多与能量代谢、蛋白质定位以及种子发育有关，而经GAs处理的种子相应破眠蛋白多与能量代谢、植物防御有关，由此推测种子休眠状态的解除涉及多种蛋白质的参与，从最初的信号产生、信号转导、转录、蛋白质合成、能量代谢、贮藏物质动员到最后的细胞再生都与种子休眠密切相关［36］。在研究ABA和GAs两种激素对挪威槭（Acer platanoides L.）种子休眠解除和萌发的影响，发现ABA调控大多数蛋白下调表达，而GAs调控蛋白上调表达，并且多数蛋白质变化都发生在种子层积后期，此时正是种子从静止状态向萌发转变的活跃时期。其中S－腺苷甲硫氨酸合成酶、富含甘氨酸RNA结合蛋白、ABI 3－互作蛋白Ⅰ，EF－2和腺苷高半胱氨酸酶对打破休眠起着关键作用［37］。

3 种子萌发相关的蛋白质组研究

种子萌发是胚从相对静止状态变为生理活跃状态，并长成自养幼苗的一系列过程。萌发以种子吸水为开始，胚根的出现为结束。种子萌发分为3个阶段：第Ⅰ个阶段种子吸水膨胀，鲜重迅速增加，成熟种子中的蛋白质被激活；第Ⅱ阶段为代谢发生阶段，种子鲜重几乎不增加，依靠成熟种子中储存的mRNA合成蛋白质，建立代谢体系；第Ⅲ阶段幼苗形态建成，胚根突破种皮，标志着种子萌发结束，这一阶段生长迅速，鲜重增加［38］。在通常情况下，蛋白质组学研究的主要生物过程为第Ⅰ和第Ⅱ阶段［39］。

3.1 种子吸胀相关的蛋白质

近年来，涉及种子吸胀过程的一些蛋白质已经得到鉴定，例如α和β－微管蛋白、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）、顺乌头酸酶、过氧化氢酶、WD－40重复蛋白以及ACT蛋白等。种子萌动后，内部贮藏物质需要经过分解，才可以转移到胚中来支持其迅速生长，并需要迅速合成相应的酶类。在大麦萌发的种子中发现大量的α－淀粉酶（AMY）的同工型蛋白质，在胚乳贮藏淀粉的快速降解中至少存在1种AMY 1蛋白和2种AMY 2蛋白［40］。硫氧还蛋白（Trx）是一种重要的酶活力调节蛋白，能提高淀粉酶活性和蛋白酶活性，增加贮藏蛋白的水溶性，使种子中贮藏的营养物质更容易水解，启动碳氮代谢。在大麦种子萌发的研究中发现，随着Trx活性的上升，淀粉酶活性、贮藏蛋白的相对还原状态有所上升［41］。在狭叶南洋杉种子萌发期间也发现硫氧还蛋白高度表达，该蛋白与细胞自由基清除有关［42］。拟南芥中股氧化物的酶类丰度变化显著，酶活性方便检测，且与种子萌发密切相关。抗坏血酸（AsA）是植物中一种重要的氧化还原缓冲物，可以有效的保持细胞的还原状态，而单脱氢抗坏血酸还原酶（MDAR）与AsA的再生有关；MDAR蛋白在大麦吸水膨胀阶段丰度变化显著，可以推测该蛋白参与种子萌发初期阶段的代谢调节［43－44］。

3.2 种子代谢相关的蛋白质

这一阶段氨基酸代谢、储藏物质代谢、蛋白质翻译、能源代谢等几类蛋白的丰度发生变化，而且至少要三类蛋白共同作才能完成种子向幼苗状态的转换。其中，甲硫氨酸合酶、半胱氨酸合酶、SAM－合酶、天冬氨酸氨基转移酶为氨基酸代谢类的蛋白，前两种蛋白与紫花苜蓿种子萌发有关，后两种与拟南芥萌发相关［45－46］。储藏物质代谢相关的蛋白也发挥重要作用，如蛋白酶和淀粉酶等在这一阶段活性较高［47］。参与吸胀的蛋白HSPs、LEA在这一阶段也发挥作用。延伸因子、蛋白质二硫键异构酶（PDI）、核糖体蛋白等与翻译相关的蛋白，在这一阶段发挥重要作用［48］。其中，延伸因子与翻译后的mRNA转运到细胞质有关，也与细胞分裂过程关系密切［49］，PDI与新生肽链二硫键合成和异构相关［50］。与能量代谢相关的蛋白主要集中在代谢阶段，如UDP－葡萄糖焦磷酸化酶、磷酸果糖激酶、3－磷酸甘油醛脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等，与糖酵解途径密切相关［51］。

3.3 种子生根相关的蛋白质

有研究发现，芥子酶、SAM－合成酶、LEA、HSP、种子成熟蛋白－SMP和延伸因子EF－Tu都参与了胚根的 伸 长 过 程［52］。Vivek 等 发 现，在 桃 儿 七（Podophyllum hexandrumRoyle）种子萌发期间细胞壁水解酶如β－1，3－葡聚糖酶、XET、CDC 2激酶以及SDH等表达上调，促进胚根伸出［53］，从而在蛋白质组的水平上验证了Sreenivasulu等［54］认为的桃儿七种子萌发困难是由于胚乳细胞壁较厚导致的这一猜想。

3.4 种子萌发期间代谢途径的研究

利用蛋白质组学技术研究种子萌发期间相关蛋白质组的变化，能够系统地掌握更多复杂生理过程的调控网络，其中糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）作为核心代谢途径，为种子萌发过程提供大量能量，其相关的蛋白质也在许多物种的蛋白质组学研究中得以鉴定，从而建立种子萌发时期的代谢蛋白图谱。

种子吸胀后，氨基酸和相关的有机酸的含量连续地增加，并且磷酸化的糖，包括果糖－6－磷酸和葡萄糖－6－磷酸，含量急速增加，这表明分解代谢被激活。其中磷酸化糖需要转化成蔗糖，才能进到糖酵解途径来提供能量。在水稻种子萌发不同时期蛋白质变化的研究中，有148个蛋白表达差异，其中上调表达的蛋白主要是参与EMP的酶途径，包括UDP－葡萄糖脱氢酶、果糖激酶、葡萄糖磷酸变位酶和丙酮酸脱羧酶［55］。UDP－葡萄糖焦磷酸化酶、3－磷酸甘油醛脱氢为EMP途径中关键蛋白，与种子活力呈正相关［56］。丙酮酸脱氢酶复合体、异柠檬酸脱氢酶为TCA循环中关键蛋白，能够调节TCA途径的活性，其中，丙酮酸脱氢酶复合体可以催化丙酮酸转化为乙酰－CoA，完成EMP和TCA途径的连接，而该蛋白的减少会限制种子内氧气的消耗，产生有毒物质，从而影响种子萌发［5］。

戊糖磷酸途径（PPP）是葡萄糖另一条有氧代谢途径，有研究表明PPP与种子萌发相关，调节PPP途径与EMP途径之间的平衡，有助于种子萌发。测定葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PDH）和6－磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6－PGDH）是PPP途径的关键酶，在种子萌发研究中，多数是通过生理方法测定酶活，因此用蛋白质组学的方法中鉴定该途径差异蛋白的报道并不多。乙醛酸循环中的关键酶为苹果酸脱氢酶，Ghosh在绿豆子叶中鉴定出该酶，以确定种子萌发中乙醛酸循环的存在，脂肪酸经过此循环产生琥珀酸［57］。

4 展 望

蛋白质组学原理的提出和技术的建立，解决了在蛋白质水平上大规模的直接研究基因功能的问题，为研究种子发育、休眠和萌发的分子机理提供了有效的手段。现阶段一些通过基因组测序而新发现基因编码的蛋白质功能都无从查询，而对那些已知功能的蛋白质而言，可以通过同源基因功能类推等方法来确定期功能。因此，基因组学、转录组学与蛋白质组学的相互结合，能深入地研究种子发育萌发过程中mRNA与蛋白质的相关性、蛋白质之间的相互作用以及其代谢通路。这为揭示种子休眠与萌发机制提供强有力保障，为种子基因组的研究提供有力依据，从而为更多农业生产问题的解决提供理论指导。

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