牛乳铁蛋白肽的抑菌功能及基因工程制备进展

张云威,　苏　航,　刁　勇,　戚智青

华侨大学生物医学学院, 福建 泉州 362021



牛乳铁蛋白肽的抑菌功能及基因工程制备进展

张云威,苏航,刁勇,戚智青*

华侨大学生物医学学院, 福建 泉州 362021

牛乳铁蛋白肽(lactoferricin bovine，LfcinB)是由乳铁蛋白(lactoferrin)经酸性胃蛋白酶降解N端而产生的含25个氨基酸残基的小肽，它具有抗菌、抗癌、抗氧化、免疫调节等一系列生物活性，成为目前研究与开发的热点。由于受到生产成本的限制，无法进行大规模商业化生产，基因工程技术将是实现大规模生产的最佳途径。对牛乳铁蛋白肽的抑菌功能以及基因工程制备的优势和改良方法进行了综述，旨在为基因工程生产牛乳铁蛋白肽提供新思路。

牛乳铁蛋白肽；抗菌肽；基因工程

乳铁蛋白肽(Lfcin)是一种广泛存在于自然界并参与机体非特异性免疫的生物活性多肽。它不仅存在于哺乳动物的乳汁中，也广泛分布在泪液、唾液、胰液、血液、精液、小肠液、胆汁和羊水等分泌物中，且初乳中含量最高[1]。自乳铁蛋白肽首次被分离获得以来，目前发现牛乳铁蛋白肽(LfcinB)的抗菌活性最强，因此成为主要的研究对象。LfcinB不仅抗菌，而且具备抗病毒、抗癌、消炎、调节免疫反应、抗氧化、抗分解代谢[2]等一系列生物活性，其本身也不含稀有氨基酸和外源化学成分，可以被机体中的酶消化吸收，不具有免疫原性，因此是一种安全、环保、高效的新型生物抗菌肽。在医疗、食品、饲料、保鲜等领域展现了广泛的应用前景，而成为研究和关注的热点。

目前国内外制备LfcinB的主要问题在于来源困难和纯化LfcinB需采用多种分离纯化方法，造成成本太高，很多研究只限于实验室，难以实现工业化生产，因此采用基因工程技术解决LfcinB的来源问题，同时优化LfcinB的纯化工艺实现工业化生产对新一代生物抗菌肽发展具有重大意义。

1　牛乳铁蛋白肽的抑菌功能

Abe等[3]进行了脱铁型乳铁蛋白(lactoferrin)在pH 2.0～3.0条件下的热稳定性实验，发现乳铁蛋白发生了明显的降解，但是其抗菌活性却大大增加，于是推测乳铁蛋白中存在耐热的抗菌多肽。同时用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理乳铁蛋白，虽然会影响乳铁蛋白的空间结构和抗原性，但不能消除乳铁蛋白的抗菌效果[4]，这一点也说明乳铁蛋白中存在抗菌肽。之后又相继发现多种动物中存在抗菌肽，其中以LfcinB的抗菌效果最为显著。LfcinB在生物活性上与乳铁蛋白(lactoferrin)几乎一致，其不同点就是不能与铁离子相结合，但牛乳铁蛋白肽具有更强的抗菌能力[5]。目前研究最多的也是它的抗菌活性，它具有广谱的抗菌效果。其抗菌机理主要是通过阻断菌类对铁源的吸收[6]或通过影响细胞的遗传物质和细胞器来达到抑菌的功能[7]。但对于不同的菌类具有不同程度的抑菌效果，这主要是因为某些细菌细胞膜表面存在一种可以抵抗乳铁蛋白(LF)杀伤力的蛋白受体——乳铁蛋白结合蛋白B (LbpB)[8]。

根据Bellamy等[9]用LfcinB对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、需氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌等近40种菌进行了抑菌实验，发现LfcinB不仅可以抑制细菌，对丝状真菌、酵母菌也有不同程度的抑制，如烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus)、青霉(Penicilliumpinophilum)和隐球酵母菌(Cryptococcusuniguttulatus)等，尤其是对大肠杆菌(Escherichiacoli)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、链球菌(Streptococcus)、微球菌(Micrococca)、产气夹膜梭菌(Clostridiumperfringens)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus)、白色念珠菌(Moniliaalbican)等具有较强的抑制作用。其中LfcinB对粪肠道球菌(Entercoccusfaecalis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的抑菌效果最差，而对人类肠道消化有益的菌种如双歧杆菌(Bifidobacteriun)完全没有抵抗作用，同时还能增加溶菌酶活性和有机酸的含量，刺激细胞生长，降低胃肠道液的pH;对其他的菌株也在不同程度上达到了抑制效果。通过分析菌种可以看出，LfcinB对革兰氏阳性菌更为敏感，其抑菌浓度大致在0.6～45 μg/mL。

食品安全与民生息息相关，开发全天然、绿色、无污染的新型抗菌肽具有重大意义。而LfcinB抗菌种类多且抗菌效果突出，同时LfcinB的抗菌种类大多是肉类、鱼类、蔬菜、水果腐败的主要菌种。然而LfcinB的开发却受到LfcinB来源困难、成本高等因素的限制，难以实现大规模生产，限制了其利用。随着分子生物学技术的发展，利用基因工程技术将是实现LfcinB低成本大规模生产最有效的途径。

2　采用基因工程技术生产牛乳铁蛋白肽

牛体内牛乳铁蛋白肽的含量很少，利用蛋白酶体外水解牛乳铁蛋白分离操作复杂、原材料获取困难、费用高，不能满足大规模生产利用的需要，而化学合成法往往适用于合成一些高价的药理级肽，对于牛乳铁蛋白肽的合成成本太高，同时可能会产生一些对人体有害的副产品。目前研究表明利用基因工程中DNA体外重组技术可在不同的表达系统中实现有效表达，但与其他方法相比技术尚未成熟，其限制因素主要在于表达牛乳铁蛋白肽的产率、活性均较低，后期的分离存在问题，因此利用基因工程技术生产LfcinB和改良基因工程技术是目前实现牛乳铁蛋白肽低成本工业化生产最有效的途径。

2.1LfcinB基因工程制备的优势

基因工程制备LfcinB主要有以下几个方面的优势：①牛乳铁蛋白肽的分子量约为3 100 Da，一级结构由25个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF。分子量小，序列较短容易合成，有利于DNA的体外重组；②LfcinB的2个半胱氨酸(Cys)会形成分子内二硫键，使其形成一个类似环状的结构，这个结构可以有效的阻止蛋白酶对LfcinB的降解，但该结构对其抑菌作用并没有明显的影响。Hoek等[10]研究发现当二硫键被破坏后，失去了环状结构依然具有与LfcinB相似的抑菌活性。因此在利用原核和真核生物表达系统时，即使缺少翻译后精准的加工修饰过程，不能有效的形成二硫键，也不会影响其抗菌方面的应用，减少了基因工程技术操作难度；③Vogel等[11]分析了LfcinB中的结构与抗菌活性间的关系，发现LfcinB中的11个氨基酸(RRWQWRMKKL)具有与完整肽链相同的抗菌活性。Hilchie等[12]研究认为其活性中心是色氨酸/精氨酸(Trp/Arg)集中的区域(RRWQWR)。所以利用基因工程技术表达时，即使出现个别碱基的缺少或者突变，只要保证其活性中心的碱基序列正常，可能就不会影响其抗菌活性。同时利用这一点还可以对牛乳铁蛋白肽的氨基酸序列进行修饰，减少氨基酸合成的数目，降低基因工程的操作难度，使其能够更有效的表达。④ LfcinB在其完整结构中呈现的二级结构是α螺旋结构，当LfcinB从牛乳铁蛋白上水解下来时，其二级结构会转变成β折叠结构，而β折叠结构比α螺旋结构更有利于与细胞膜接触。这一特性减少了利用基因工程技术对一些进行高级结构修饰后需要保证其原有的空间结构才能发挥功能的物质的操作难度。

可见利用基因工程技术生产LfcinB存在众多优点。但是不同的表达系统也存在各自的优缺点，针对这些缺点，基因工程改良制备是实现LfcinB工业化生产的有效途径。

2.2LfcinB基因工程改良制备

不同的表达系统存在不同的优缺点，目前主要利用大肠杆菌表达系统和酵母菌表达系统进行LfcinB的生产。一方面这两种表达系统的基因表达调控机理比较清楚，另一方面遗传操作相对比较简单。但这两种表达系统都有各自的缺陷，基于这些缺陷人们开始探索LfcinB在基因工程上的改良。目前主要有以下几种方案。

2.2.1改良LfcinB抗菌活性LfcinB的抗菌过程中，色氨酸(Trp)起了关键的作用，Trp中的芳香环结构与膜表面上的甘油相互作用，促进了LfcinB与质膜的有效结合。Strom等[13]利用基因突变技术将LfcinB上的第6位的色氨酸(Trp)突变成了丙氨酸(Ala)后，发现其抗菌活性明显下降。同时发现其他物种的Lfcin中增加Trp的数量，能够增加其抗菌活性[14]。Murata等[15]通过加入牛奶核糖核酸酶(MR15)可有效增强乳铁蛋白肽的抗菌活性，因此推测乳铁蛋白在体内可能与MR15结合共同发挥抗菌能力。尽管这些方法提高了LfcinB的抗菌活性，但提高的幅度相对较小，甚至增加了生产成本，因此并不能解决LfcinB在生产过程中高成本的问题。

2.2.2融合表达因为LfcinB抗菌作用影响了大肠杆菌和酵母菌的正常生长，使得培养后达不到较高的浓度，这一缺点现在多采用融合表达予以克服。田子罡等[16]利用pET32a质粒在E.coliBL-21实现 LfcinB15-W4，10的串联融合表达，经分离后具有抗菌活性。 Kim等[17]利用乳铁蛋白肽与银离子肽成功在大肠杆菌中实现了融合表达，同时也具有抗菌活性；分析原因可能是LfcinB发挥抗菌作用与LfcinB本身的两性特征分不开，当进行融合表达时由于N端的封闭以及受到周围其他氨基酸的影响，破坏了原有的空间结构，使LfcinB抗菌活性大大降低，不影响表达系统中菌类的正常生长。这一方法虽然提高了表达量，但在后续的纯化过程中依然面临复杂繁琐的分离操作，难以实现低成本制备。

2.2.3复性大肠杆菌在表达真核生物蛋白时形成包涵体，目前多采用离心、洗涤、重悬和超声波破碎等方式获得包涵体，再采用氧化型的溶剂进行复性处理得到目的蛋白。包涵体的形成有效地将体内可溶性蛋白进行了区分，同时避免了蛋白酶对目的蛋白的降解，提高了目的蛋白的产率。但是蛋白包涵体的形成也加大了目的蛋白的生产成本，尤其是复性过程中常常伴随着蛋白质的沉淀和水解[18]。因此成为蛋白质工程中最为复杂的一个环节。LfcinB在表达抑菌功能时，并不需要很高级的空间结构，因此利用大肠杆菌表达LfcinB降低了复性的操作难度。

虽然基因工程技术实现了对LfcinB的生产，但在产物的纯化效率和活性等方面严重制约了LfcinB投入商业化的进程。因此未来更多的研究方向应该集中在如何降低LfcinB的生产成本。可通过将修饰LfcinB的基因与其他基因片段进行融合表达，这样既解决了表达量的问题，同时又提高了LfcinB的抗菌活性。也可通过从一些嗜热、嗜强酸、嗜强碱的菌类中分离其作用片段与LfcinB进行融合表达，借助融合基因的特点大大的简化分离操作。这一点暂时还没有实验证明。但是一旦证明可行，不仅可降低LfcinB的制备成本，同时也有可能应用到其他生物活性肽的制备中。

3　展望

LfcinB的研究始于20世纪80～90年代，早期的研究主要集中在对不同生物体Lfcin的抗菌效果、抗菌种类、抗菌机制和结构等方面的研究。目前的研究主要倾向于LfcinB的抗病毒、抗癌、免疫等医学方面的研究。而很少涉及到将LfcinB制成食品保鲜剂、抗生素、饲料添加剂、乳制品添加剂等用于日常生活中。随着生物技术的不断发展，利用转基因技术解决其来源不足的问题已经成为趋势，许多研究人员已相继在不同的生物表达体系中实现了对LfcinB的表达。其优势一方面在于LfcinB的肽链比较短，容易构建基因重组的载体，另外LfcinB发挥抗菌作用的氨基酸数量较少，出现基因突变很少影响其抗菌能力。因此利用基因工程技术进行大规模有效的生产，无疑是未来最佳的选择。这方面的发展也同时受到了国内外许多商业机构和研究部门的认同和高度关注。

关于LfcinB的研究已经做了相当多的工作，而对于牛乳铁蛋白中的另一抗菌肽Lfampin的研究却较少，van der Kraan等[19]在白色念珠菌和大肠杆菌中做了研究，发现这两段肽会有几分钟的内在化，同时扰乱细胞膜的完整性，在膜的表面出现了一个类似囊状的结构，而且Lfampin的囊状化程度高于LfcinB，这一点说明Lfampin在某些菌类中的抗菌效果可能优于LfcinB。Flores-Villaseor等[20]通过对LfcinB、Lfampin以及这两者组合成的联合肽(LFchimera)对耐药性的大肠杆菌和金黄色葡糖球菌进行了抗菌性比较，发现LFchimera要优于LfcinB和Lfampin的抗菌效果。因此在加大LfcinB的研究和开发力度的同时，加大对Lfampin的开发以及这种联合表达方式的研究，采用多种抗菌肽联合使用，来达到更好的抑菌效果。

LfcinB生产成本是目前亟待解决的问题。而一旦解决了LfcinB的生产工艺和成本问题。不仅有利于新型天然保鲜剂的开发、抗生素的生产，同时对食品、化妆品、饲料、医疗、药物等各个领域的研究都是一个重大的突破，有望实现新一代抗菌类产品的开发和利用。

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Progress on Antibacterial Function and Preparation by Genetic Engineering of Bovine Lactoferrin

ZHANG Yun-wei, SU Hang, DIAO Yong, QI Zhi-qing*

CollegeofBiomedicine,HuaqiaoUniversity,FujianQuanzhou362021,China

Lactoferricin bovine(LfcinB) is a kind of small peptide which derives from lactoferrin when it was mainly generated by the pepsin-mediated digestion from N-terminal of lactoferrin. It contains 25 amino acids residues and a number of biological functions, including antimicrobial, anticancer, antioxidant and immunomodulatory effects. So LfcinB has become the focus of research. To date, high process production costs made it difficult to produce on more commercial level scale. Genetic engineering will be the best method to produce LfcinB. This paper gave an overview on antimicrobial activities of LfcinB and its production by genetic engineering including the advantage and improve, which aimed to provide new ideas about genetic engineering produce LfcinB.

lactoferricin bovine; antibacterial peptides; genetic engineering

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.02

2016-03-01; 接受日期：2016-04-08

福建省科技计划项目(2016N51010032) 资助。

张云威，硕士研究生，研究方向分子生物学。E-mail：932136251@qq.com。*通信作者：戚智青，教授，博士，博士生导师，主要从事基因工程研究。E-mail：zqqi@hotmail.com