CHO细胞表达系统研究进展

郑惠惠,　江　洪

北京万达因生物医学技术有限责任公司, 北京 141017



CHO细胞表达系统研究进展

郑惠惠,江洪*

北京万达因生物医学技术有限责任公司, 北京 141017

CHO细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展，CHO细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统，并被广泛应用于抗体、重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中。近年来，针对CHO细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足，研究者们通过利用基因工程技术手段，结合重组蛋白表达机制的研究成果，为优化和应用CHO细胞表达系统做出了不懈努力。从培养基的优化、高产重组CHO细胞株的构建、大规模培养三个方面综述了CHO细胞表达系统的最近研究进展，以期为CHO细胞表达系统的研究与应用提供参考。

CHO细胞培养；细胞改造；重组抗原表达

CHO 细胞是由Puck于1957年建成的中国仓鼠卵巢成纤维细胞系。发展至今，CHO细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统。随着无血清悬浮培养技术、基因工程技术、生物反应器设计放大与强化技术、大规模高密度流加和连续灌注培养技术等的发展，CHO细胞系统被广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产中。

CHO 细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。因为它具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子。但CHO细胞在无血清培养基中会出现活力差、分泌外源蛋白能力弱等问题。所以建立稳定、高产的重组CHO细胞成为很多研究者的目标。近年来，研究者从细胞营养、代谢、凋亡、信号传导等角度，结合蛋白表达机制等研究成果，对这一目标的实现做出了很多努力。本文从培养基优化、高产重组CHO细胞株的构建、大规模培养三个方面综述了CHO细胞表达系统的最新研究进展,以期为CHO细胞表达系统的应用提供参考。

1　培养基的优化

研究发现，不同的细胞株甚至克隆对营养成分的需求都有差别。通过筛选比较不同培养基成分对重组抗原生产的影响，并开发适用于不同重组CHO细胞株的培养基，成为很多研究者提高CHO细胞表达系统产量的重要方式。为了维持细胞在无血清培养基中的正常生长，需要在基础培养基中添加很多其他因子，如激素、生长因子、蛋白水解物等。

蛋白质水解物含有丰富的营养成分，可有效缩短细胞对无血清培养基的适应过程。Davami等[1]通过组合比较不同来源的蛋白水解物对细胞密度及表达产量的影响，优化得到更适于DG44的培养基。酵母水解物作为一种成本较低的非动物源蛋白水解物，可以使细胞密度增加的同时，使重组表达抗体的表达量大幅提高[2]。大豆水解物等都可以被添加到基础培养基中[1,3,4]。由于蛋白水解物的构成复杂，且批间差异大，因此蛋白水解物的添加会影响细胞培养基批次间的稳定性。如果去除培养基中的蛋白质水解物，需要添加氨基酸或微量元素等，通过优化调整其比例，仍能支持高密度的CHO细胞培养[5]。

刘兴茂等[6]采用Plackett-Burman实验对影响细胞生长的培养添加成分进行了考察，确定了腐胺、胰岛素及转铁蛋白对11G-S细胞的悬浮培养有明显的生长促进作用。设计的培养基可以使细胞最大生长密度达到4.12×106cells/mL。Xu等[7]采用Plackett-Burman设计与支持向量机(SVM)预测并实验确定了硫酸锌、转铁蛋白及BSA对CHO-K1细胞的生长有促进作用。另有研究表明，使用柠檬酸铁作为转铁蛋白的替代物，可以使细胞的密度达到7.0 ×106cells/mL，但是会降低转染效率[8]。Miki等[9]研究发现，添加生长因子IGF-1和脂类信号分子溶血磷脂酸(LPA)也可以有效加速CHO细胞生长。

优化培养基能有效提高重组CHO细胞的培养密度。高密度的CHO细胞培养是CHO细胞表达系统实现工业化生产应用的必要条件之一。与大肠杆菌和酵母表达系统相比，CHO细胞有生长较慢、培养周期较长、产量较低等缺点。为了提高重组蛋白产量、扩大CHO细胞表达系统的生产应用范围，研究者们在优化培养基的实验基础上，构建高产的重组CHO细胞系，为大规模的重组蛋白生产提供基础。

2　高产重组CHO细胞株的构建

研究者们利用发展迅速的基因编辑技术对CHO细胞进行筛选和改造，得到高产的重组细胞株。研究者们通过过量表达或敲除某个基因，调整代谢途径、延缓细胞凋亡、增强转录表达效率，有效的增加了重组蛋白产量。通过结合全基因组测序和基因敲除技术的研究成果，研究者们为得到反应性更好的糖基化重组蛋白做出了不懈努力。

2.1调整代谢途径

乳酸作为糖酵解产生的代谢产物会影响细胞生长。Zhou等[10]使用siRNA 技术降低乳酸脱氢酶A(LDHa)和丙铜酸脱氢酶激酶(PDHKs)基因的表达，使乳酸的产生降低了90%，并增加了单抗的产量。Toussaint等[11]通过在rCHO中表达酵母丙酮酸羧化酶(PYC2)，改变了流加培养方式中葡萄糖的代谢速率，增长了细胞的对数生长期，从而增加了细胞密度及产量。

2.2延缓细胞凋亡

为了延长细胞培养的时间从而增加产量，有研究者建立了能表达抗凋亡基因的CHO细胞系。Majos等[12]通过在CHO 中表达1个Asp29 Asn突变的抑制凋亡基因，有效延缓了细胞凋亡。也有研究者通过敲除细胞中的促凋亡基因来延缓细胞凋亡，如Cost等[13]敲除了BCL2相关蛋白X(BAX)和BAK的基因，使单克隆抗体产量增加了5倍。Ritter等[14]发现8号染色体端粒区的缺失也可以使产物产量成倍增加。

2.3增强转录表达效率

有研究者在细胞信号通路研究成果的基础上，通过表达转录及翻译过程中的相关蛋白，增强转录和表达效率，以增加目的重组蛋白的产量。Le Fourn等[15]通过在CHO中表达人信号受体蛋白SRP14，成功增加了分泌表达的重组蛋白的产量。Peng等[16]通过表达转录翻译相关蛋白SLY1、MUNC18C和XBP1，使IgG的产量提高了20倍；Rahimpour等[17]在CHO细胞中表达神经酰胺转移蛋白(CERT)的突变基因使t-PA的产量增加了35%。

2.4表达糖基化酶

能产生糖基化的重组蛋白是CHO 细胞表达系统重要的优势，研究者们通过建立能表达N-糖基化途径中不同酶类的细胞系以增加糖基化重组蛋白的反应性。如Goh[18]建立的一个含有N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I基因的突变体CHO-gmt4细胞系，其表达的重组葡萄糖脑苷脂酶将不需要多糖重构可直接用于治疗戈谢病患者。Zhang等[19]通过CHO-gmt5细胞株表达的重组抗体,其Fc的N-多糖缺少岩藻糖和唾液酸能增强ADCC的作用。根据CHO-K1的基因组信息，Yang等[20]通过锌指核酸酶(ZFNs)基因敲除的方法，研究了19种包括作用于N-糖基链分支、半乳糖基、聚LacNAc延伸、唾液酸化加盖的N-糖基转移酶对N-糖基化作用的影响，为更准确的表达特定糖基化方式的重组蛋白提供了重要参考。

重组CHO细胞表达重组蛋白能力的高低，不能简单的归结为某些关键基因的作用。为了得到高产的重组细胞株，需要研究者们综合考虑细胞的代谢情况、培养条件、蛋白表达效率和蛋白加工修饰能力等诸多因素。

3　大规模培养研究

基因工程技术、细胞融合技术及抗体类药物的迅速发展，推进了生物反应器培养技术在生物制药中的应用。由于CHO细胞能以悬浮培养的方式高密度培养，培养体积可达1 000 L以上，所以在大规模培养和重组蛋白的高产量生产中，CHO细胞表达系统拥有广阔的发展前景。在大规模生产中，通常采用流加培养方式，通过添加营养物质来延长培养时间，增加细胞密度和目的产品的浓度。为了更大程度的提高重组蛋白的生产效率，研究者们需要根据不同细胞株的生长代谢特点，选择和优化起始培养基、补料培养基及补料策略。现代计算机技术、数学算法及理论的应用，也为研究者对细胞流加培养的优化提供了很大帮助。

3.1优化培养参数

选择合适的培养基、优化细胞培养的参数(如温度、pH、溶氧、CO2浓度、渗透压等)对生产至关重要。同时，流加工艺参数(如流加培养基成分、流加时间等)均需根据不同的细胞株及反应器的特点来设计优化。Fan等[21]采用分批补料方式培养CHO细胞，实验显示培养基中的氨基酸和葡萄糖浓度对细胞的生长、IgG浓度和N-糖基化生成都很重要。Kim等[22]使用分批补料培养使IgG的产量达到2.3 g/L。通过用小麦蛋白水解物(WGH)代替补料中的谷氨酰胺可以使t-PA的产量达到422 mg/L[23]。

3.2应用新的培养技术

微载体培养是一种动物细胞大规模培养技术。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，从而可实现细胞的高密度培养。胡显文等[24]在搅拌式反应器中无血清培养分泌u-PA的DNA 重组CHO 细胞，通过部分更换Cytopore多孔微载体，解决了大规模细胞培养中细胞凋亡的问题。并使用周期变压刺激技术使u-PA的产量提高了10倍，且可以降低葡萄糖厌氧代谢产生乳酸的转化率。Ventini等[25]通过Cytodex微载体培养CHO-hTSH细胞的实验表明，培养基中微载体的数量及在rhTSH合成期开始时的细胞浓度是提高目的蛋白产量的重要参数。李智等[26]利用CHO细胞能在培养过程中自然结团的特性，采用超声沉降柱二合一灌流系统促进细胞结团和加强截留的特性，用无血清培养基连续灌流培养基因重组CHO细胞MK3-A2株，分泌表达的rhTNK-tPA生产率平均为89 mg/L·d。

3.3添加保护剂

聚醚F68可以有效减少生物反应器中搅拌对细胞产生的机械损伤。针对F68对某些细胞株的生长及产量降低的情况，研究者发现0.05%或0.075%的500 kDa的γPGA可以替代F68应用于CHO DG44细胞的培养中[27]。

在细胞培养工艺逐级放大的过程中，每一步都需要研究者们监控细胞在生长和表达方面的相关指标。生物反应器在线监控pH、溶氧等参数的功能、色谱和在线蛋白分解监测等技术为大规模培养的过程控制提供了帮助。

4　展望

CHO细胞是表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞，有其不可比拟的优点，同时也存在现行技术手段不能弥补的不足之处。结合生物信息学、细胞生物学、基因工程技术和生物反应器技术的研究成果，研究者们可以通过综合考虑细胞代谢特性、蛋白表达特性等影响因素，通过研发个性化培养条件及培养工艺，构建高表达载体，筛选稳定高产的重组细胞株，改造宿主细胞等角度继续优化CHO细胞表达系统，为产业化生产重组蛋白提供基础。

用于产业化生产的重组CHO细胞，需要具备生长特性良好、能在无血清培养基中高密度培养、表达重组蛋白能力强、能正确的进行翻译后修饰等特点。糖基化是蛋白翻译后最重要的修饰之一，直接影响重组蛋白的空间结构、生物活性、稳定性、免疫原性和生物反应性等。对重组蛋白的糖基化研究一直是研发和生产真核重组蛋白的热点课题。随着基因编辑技术的发展，研究者们通过表达特定糖基化相关酶从而得到完整、准确的特定形式的糖链结构，为糖基化蛋白在免疫诊断、临床治疗等领域的持续发展奠定了基础。随着基因技术的不断发展，对细胞代谢、信号传导等方面研究的持续深入，构建能表达准确修饰的糖基化重组蛋白的高产重组CHO细胞株仍将成为研究热点。

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Progress of CHO Expression System

ZHENG Hui-hui, JIANG Hong*

BeijingWondergenBio-medicineTechnologyCo.Ltd.,Beijing141017,China

CHO cell expression system is the preferred system for recombinant glycoprotein production. With the evolving development and applications of serum-free suspension culture technology, genetic engineering and the large-scale culture technologies, CHO cell expression system has become the most important expression or production system of biotechnology products. This system is widely used in the research and production of antibodies, recombinant proteins and vaccines. In recent years, researchers have made great efforts to improve the expression and large-scale production of recombinant proteins by using latest bioengineering technology and the development of the recombinant protein expression mechanism. This article briefly reviewed the recent development of the CHO cell expression system in three aspects: the optimization of the culture medium, construction of engineered CHO strains for high-level production and large-scale culture research, which was expected to provide reference for research and application of CHO cell expression system.

CHO cell culture; cell engineering; recombinant antigen expression

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.03

2016-02-22; 接受日期：2016-04-04

郑惠惠，技术员，主要从事真核重组抗原研发研究。E-mail：shanjvqiuming@163.com。*通信作者：江洪，工程师，主要从事重组抗原研发研究。E-mail：jiang@wondergen.com