Cu（Ⅱ）希夫碱配合物与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用

唐洁

（桂林师范高等专科学校化学与药学系，广西 桂林 541001）

Cu（Ⅱ）希夫碱配合物与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用

唐洁

（桂林师范高等专科学校化学与药学系，广西 桂林 541001）

以配体N’N’-2[(吡啶-2-基)苯亚甲基]1，2-环己二胺（H2L）为配体，合成了双核Cu（Ⅱ）配合物Cu2L，并用红外光谱（IR）、低分辨质谱（MS）、元素分析对其结构进行了表征。通过紫外可见吸收光谱法（UV）、圆二色光谱法（CD）探究金属配合物和血清白蛋白（BSA）之间的作用方式。结果表明：配合物与BSA的结合引起了蛋白质的二级结构发生变化；配合物与BSA之间的结合类型主要靠氢键和范德华力作用力结合。

希夫碱配合物；牛血清白蛋白；相互作用

血清白蛋白是最丰富的血浆蛋白，而90%以上的金属药物都能以共价键与血浆蛋白质相结合。[1]因此血清白蛋白起着存放和运输一些药物和许多其它生物活性小分子的作用。[2]当血清白蛋白与较小的分子结合后，其构象会发生改变。[3]因此，研究药物或小分子与血清白蛋白的相互作用在生物科学和临床医学倍受关注。[4]它有助于对作用机理和代谢过程的理解，并且为修饰药物结构和合成新的药物提供了一定的指导。小分子配合物在生物和医药应用，包括抗微生物、抗细菌、抗真菌、消炎和抗肿瘤活性均已被广泛报道。[5]

本文首先合成了Cu希夫碱配合物。鉴于牛的血清白蛋白（BSA）和人血清蛋白（HSA）具有相似的化学结构，我们选择BSA作为靶蛋白，研究了在生理条件下金属配合物与BSA的相互作用，通过紫外可见吸收光谱法（UV）、圆二色光谱法（CD）得出金属配合物和血清白蛋白之间作用方式。从分子水平上了解和阐明金属配合物分子与蛋白质的作用机制，为金属配合物与细胞的相互作用研究提供了参考依据。

一、实验部分

(一)仪器与试剂

实验所用试剂和药品均为分析纯。牛血清白蛋白（BSA，分子量为66210，购自Sigma公司，上海）；缓冲溶液为0.05mol·L-1的磷酸缓冲溶液（PBS），PH=7.43，其中含0.1 mol·L-1NaCl；低分辨质谱用LCQ/AD Quadrupole Ion Trap ESI-MS电喷雾质谱（Thermo-Finngan）测定；元素分析经PE2400II元素分析仪（PerkinElmer）测定；红外光谱用PE Spectrum One FT-IR Spectrometer傅立叶变换红外光谱仪（PerkinElmer）（KBr压片）测定；紫外吸收光谱经Cary-100紫外可见分光光度计（美国，Varian公司）测定；圆二色光谱用Jasco-810圆二色光谱仪（日本，Jasco公司）测定；超级恒温水浴箱控温箱（国华仪器厂）；可调试移液枪。

（二）配体（H2L）和配合物（CuL）的合成与表征

配体参照文献[6]合成方法来合成，取L配体（0.3 mmol）和CuCl22H2O（0.3 mmol）放入容积为15毫升并带有聚四氟乙烯衬底的水热反应釜中，加入15 mL无水乙醇后密封。加热到80℃，并保持72小时。然后以每小时5℃的速度缓慢冷却至40℃，可得到绿色块状晶体。将得到的晶体用无水乙醇洗涤后置于空气中自然干燥，产率为44%。元素分析（C30H30Cl4Cu2N4）理论值：C，50.36；H，4.23；N，7.83。实验值：C，50.02；H，4.33；N，7.90。FT-IR（KBr phase,cm-1）：2934 (m)，2058(s)，1643(s)，1590(s)，1442(m)，1348(m)，1318(m)，1258 (w)，1105(m)，1008(m)，955(w)，804(m)，705(m)，632(w)。ESI-MS：根据实验数据，可初步推断m/z 713.00为Cu2L的准分子离子峰[Cu2L+H][＋]。

（三）圆二色光谱的测定

往1cm的石英比色皿中加入3.0mL浓度为1.0× 10-3mol·L－1BSA溶液，用可调试移液枪依次加入一定量的浓度为1.0×10－3mol·L－1的配合物溶液，使BSA与配合物溶液的物质的量浓度比分别为1：0、1：1.5、1：3，扫描以上溶液体系的圆二色光谱，谱图中已经分别扣除了配合物溶液和PBS缓冲溶液的干扰。

（四）紫外可见吸收光谱的测定

往1cm的石英比色皿中加入3.0 mL，pH=7.43的磷酸缓冲溶液（PBS），用可调试移液枪分别往两个比色皿中加入3μl的浓度均为1×10-3mol·L-1BSA溶液，后依次加入一定量浓度为1×10-3mol·L-1的配合物溶液，使配合物与BSA的浓度之比依次增大，每次加样后均混合均匀，使之充分反应。在室温下，用Cary-100紫外可见分光光度计测定其200-400 nm范围内的紫外-可见吸收光谱。谱图中已扣除了缓冲溶液的干扰。

二、结果和讨论

(一)BSA和配合物相互作用的圆二色光谱分析

圆二色（CD）光谱法是表征蛋白质二级结构变化的最有效的手段之一，[7]其中，在远紫外区，蛋白质分子中的肽键的n→π*跃迁会产生两个特征吸收峰，在圆二色光谱中显示为两个负峰，即分别为208、222 nm处的两个负峰,这两个负峰与BSA分子的α–helix结构存在着很大的关系，[8]并且它们的吸收峰的强度可以反映蛋白质α–helix的含量。[9]图1为配合物与BSA不同浓度比例下的圆二色光谱，图中已扣除了缓冲液的影响。

图1 BSA与配合物CuL相互作用的园二色光谱图

(a)1.0×10-3mol·L－1BSA；(b)1.0×10－3mol·L－1BSA+1.5×10－3mol·L－1Cu2L；(c)1.0×10－3mol·L－1+ 3.0×10－3mol·L－1Cu2L；PH=7.43

从图1中可以看出，配合物的加入并没有引起蛋白质峰形的发生变化，但是位于208 nm和222 nm处的两个负峰的强度随着配合物的浓度增加逐渐减小，这表明配合物与BSA的结合引起了蛋白质的二级结构发生变化，导致BSA中α–helix结构含量下降，但并未导致主体构象的大变化，BSA分子中的主要构象仍为α–helix结构。[10]配合物与蛋白质中肽链上的氨基酸残基相结合，并破坏了它们之间形成的网状氢键骨架。[13]

(二)紫外-可见光谱的测定

图2 BSA与配合物相互作用的紫外可见吸收光谱图

(a)1.0×10－3mol·L－1BSA+1.5×10－5mol·L－1Cu2L；(b)1.0×10－3mol·L－1BSA+3×10－5mol·L－1Cu2L；(c)1.0×10－3mol·L－1BSA+4.5×10－5mol·L－1Cu2L；[d]1.0×10－3 mol·L－1BSA+6.0×10－5mol·L－1Cu2L；PH=7.43.

紫外-可见吸收光谱也是研究配合物的形成及蛋白质结构变化的有效方法之一，通过紫外-可见吸收光谱可以推断蛋白质分子中生色基团的环境变化。[11]血清白蛋白能产生紫外吸收光谱的主要原因是色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）残基对光的吸收。当向血清白蛋白中加入药物后，往往导致蛋白质生色团紫外吸收光谱的变化，如吸收峰红移或蓝移、吸光度的变化。

单纯的BSA有两个特征吸收峰，即203 nm附近的肽键的特征吸收峰和279 nm附近的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基中的杂环共轭双键的特征吸收峰。配合物与BSA相互作用的紫外-可见吸收光谱如图2所示，随着配合物的加入，两个吸收峰的峰位和强度均有一定的改变，但是BSA紫外吸收峰的峰形基本不变，在208nm处的吸收峰峰位和强度变化相对比较明显，即吸收峰的强度明显降低，出现明显的减色效应并且同时出现一定的红移现象，而在278 nm处的吸收峰蓝移至277 nm处，出现了增色效应，强度增强。血清白蛋白在220 nm附近的吸收峰主要是由于血清白蛋白特征键肽键C=O的ππ*跃迁引起的，而在278 nm处的吸收峰是色氨酸残基的特征吸收峰。这说明了血清白蛋白中的色氨酸残基与配合物发生了相互作用，导致了BSA中色氨酸残基的微环境发生了改变，使BSA的构象发生了变化。

三、结论

综上所述，希夫碱配合物Cu2L能使血清白蛋白BSA的构象发生改变，证实了小分子与血清白蛋白发生了相互作用。

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Interaction of Cu(II)Schiff Base Complexes with Bovine Serum Albumin(BSA)

Tang Jie
(Department of Chemistry and Pharmacy,Guilin Normal College,Guilin,Guangxi,541001,China)

A Cu(Ⅱ)complex(Cu2L)derived from Schiff base ligand(H2L=N’,N’-bis[(pyridine-2-yl)benzybenzylidene]ethane-1,2-diamine)was synthesized and characterized by IR,NMR,MS.The binding way of complex and bovine serum albumin(BSA)was investigated.The results showed that the combination with compound caused the change in the secondary structure of the protein.The binding types of complex and BSA were mainly based on hydrogen bond and Van der Waals'force.

schiff base complexes;bovine serum albumin;interaction

O62

A

1001-7070（2016）01-0131-03

（责任编辑：杨建香）

2015-12-01

唐洁（1981-），女，广西桂林人，桂林师范高等专科学校讲师，主要从事生物无机方面的研究。