中国花生主产区根际土壤真菌多样性及区系分析

李爱军，姚彦坡，张立田，肖　琎，周　鑫，张　鑫，项爱丽，张建民，董李学

(唐山市畜牧水产品质量监测中心/农业部农产品质量安全风险评估实验站，河北 唐山 063000)



中国花生主产区根际土壤真菌多样性及区系分析

李爱军，姚彦坡*，张立田，肖琎，周鑫，张鑫，项爱丽，张建民，董李学

(唐山市畜牧水产品质量监测中心/农业部农产品质量安全风险评估实验站，河北 唐山 063000)

摘要：本实验对采自全国花生主产区10个省市15个区县的105份花生根际土壤样品中的1255株真菌进行了区系分析，初步明确了不同产区花生根际土壤中常见真菌种类及真菌数量的差异。采用形态学分类的方法，归属21个属，大多数为有丝分裂真菌，其中，16个属为有丝分裂真菌，2个属为卵菌，3个属为子囊菌。青霉属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)、镰孢菌属(Fusarium)出现频率较高，其数量分别占分离真菌总数量的32.9%，16.2%和8.6%。

关键词：花生；土壤；真菌；多样性；区系分析

花生是我国重要的经济作物和出口创汇农产品之一，甚至在一些地区农业生产中占有主导地位。近年，随着农业种植结构调整和市场需求不断扩大，我国花生种植面积逐年递增，但随之而来的是各种花生病害的发生有增加趋势，特别是土壤传播病害的种类和发生程度尤重。土壤是各种微生物重要的栖境之一，这就为包括真菌在内的微生物的生长创造了适宜的生存条件和环境。花生根际土壤中既存在着多种病原真菌，同时也存在着大量的有益真菌。目前，国内外对花生根际土壤的研究多集中在土壤污染和理化条件研究方面，对花生土壤中真菌的区系分析及种类多样性研究鲜有报道。因此，本实验目的是对我国花生主要种植区域的根际土壤真菌种类及多样性进行系统分析，以期深入了解花生根际土壤中真菌组成、种类及多样性，对研究和防治花生各种病害起到重要的参考作用。

1材料与方法

1.1花生根际土样的采集

2014年3-10月，从我国11个省市15个区县(河北：大名、丰南；河南：驻马店；湖南：邵阳；山东：聊城，冠县，高唐；吉林：白城；湖北：阳逻；四川：西充；天津：宝坻；辽宁：阜新；山西：定襄；重庆：奉节，石柱)不同花生种植区采集土壤样品共105余份，取样采取5点取样法[1]。采集时先拨去表层土壤及覆着的枯枝落叶，在植物根际采集土壤，采集深度为3～8cm，然后将5个点的土壤样品充分混合，迅速装于无菌的塑料袋中，进行真菌分离和培养，余下部分置于低温冰箱中保存。

1.2根际土壤真菌的分离

1.2.1供试培养基的选择本次实验选用多种培养基，包括孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)、胡萝卜葡萄糖琼脂培养基等，其中孟加拉红培养基的分离效果最好，获得的真菌种类较多，对真菌菌丝的生长具有抑制生长的作用，对细菌滋生也有较强的抑制作用，便于真菌纯化和菌落计数。

1.2.2土壤真菌数量测定采用稀释平板法测定[2]，土壤稀释液涂布接种，记录培养皿上出现的菌落数，计算1g土壤中含有的真菌数量，每个土样3次重复。

1.3土壤真菌分离与鉴定方法

稀释平板法[2]：称取1 g土样置于9 mL无菌水中，充分振荡混匀，连续稀释1×103～1×104。取0.3 mL稀释液置于孟加拉红、PDA、PSA或其他培养基中进行培养，常温下培养5～7 d，待长出菌落进行计数后分别将各真菌转移至新的PDA培养基上纯化，后保存菌种以待鉴定。该方法主要用于分离产孢能力较高的半知菌、子囊菌和卵菌，例如青霉属、曲霉属、拟青霉属、粘帚霉属、镰孢属、枝顶孢属和枝孢属等。

真菌鉴定主要采用形态学方法和显微结构观察法，形态学方法主要观测真菌菌落的颜色、形态、生长速度、色素产生等特征；显微结构观察法主要检测各菌落的营养体和繁殖体的形态特征等，将真菌鉴定到属[3-6]。

2结果与分析

2.1花生根际土壤真菌数量分析

图1可见，不同地区土壤真菌数量表现一定差异。真菌数量从高到低顺序为：河北大名、河北丰南、河南驻马店、湖南邵阳、山东冠县、吉林白城、湖北阳逻、四川西充、天津宝坻、辽宁阜新、山

图1　不同地区土壤真菌数量统计Fig. 1　Species and amount of fungi in different areas注： A：河北大名 B：河南驻马店 C：辽宁阜新 D：湖南邵阳 E：河北丰南 F：山西定襄 G：四川西充 H：山东冠县 I：重庆奉节 J：天津宝坻 K：山东高唐 L：吉林白城 M：重庆石柱 N：湖北阳逻 O：山东聊城。附表同。Note: A: Daming Hebei; B: Zhumadian Henan; C: Fuxin Liaoning; D: Shaoyang Hunan; E: Fengnan Hebei; F: Dingrang Shanxi; G: Xichong Sichuan; H: Guanxian Shandong; I: Fengjie Chongqing; J: Baodi Tianjin; K: Gaotang Shandong; L: Baicheng Jilin; M: Shizhu Chongqing; N: Yangluo Hubei; O: Liaocheng Shandong. The same below.

东聊城、山东高唐、山西定襄、重庆奉节及石柱。河北大名土壤真菌数量最高，达2.3×105cfu/g，重庆奉节土壤真菌数量最低，仅为0.8×105cfu/g。另外，不同地区花生土壤中分离到的真菌种类显著不同，北方土壤中真菌的种类明显多于南方，东部高于西部。

2.2花生根际土壤真菌多样性

全国15个花生主产区县105份根际土壤样品共分离鉴定出真菌21个属(附表)及1255株真菌。其中，有丝分裂真菌16属，分别为青霉属Penicillium，镰孢霉属Fusarium，曲霉属Aspergillus，拟青霉属Paecilomyces，轮枝孢属Verticillium，木霉属Trichoderma，枝顶孢属Acremonium，腐质霉属Humicola，粘帚霉属Gliocladium，蜜孢霉属Sphacelia，粘束孢属Graphium，瓶霉属Phialophora，芽链束梗孢属Pycnostysanus，褐孢霉属Fulvia，节卵孢属Oospora，金孢霉属Chrysosporium等。其他属包括：胶盘孢属Hainesia，毛霉属Mucor，笄霉属Choanephora，疫霉属Phytophthora及腐霉属Pythium。

附表　不同区域真菌群落组成

实验获得的21个属真菌中，绝大多数属于半知菌真菌，此外，还包括子囊菌、卵菌、接合菌，没有分离获得担子菌，低等的卵菌在培养基上均未产生有性阶段。本试验分离到的可以引起花生病害的真菌种类有镰孢霉属、枝顶孢属、曲霉属、青霉属、轮枝孢属、疫霉属、腐霉属等，镰孢菌分离到170株，占总数的13.9%，曲霉属分离到82株，占总数的6.7%，青霉分离到224株，疫霉菌分离到54株，枝顶孢分离到40株，轮枝孢分离到33株。说明不同地区花生土壤中具有成为病原菌的大量真菌存在。此外，从鉴定的结果可以看出，花生土壤中有大量可以作为生防菌的潜在真菌微生物存在。花生根际土壤中分离到的具有生防潜力的真菌有木霉菌、粘轴霉、拟青霉、青霉等，其中木霉菌81株占分离真菌总数6.6%，说明我国花生根际土壤中具有生防潜力的微生物广泛存在。

2.3优势种群

分离结果表明(图2)，105份花生根际土样中分离到大量的木霉菌、粘轴霉、青霉菌，说明这些可做为潜在生防菌的真菌在我国花生主产区广泛分布，此外，所有花生产区土样中均大量分离到镰孢霉属的真菌，这与我国花生主产区根腐病普遍较严重相吻合，说明引起我国根腐病的主因可能为镰刀菌。研究指出，我国花生根际土壤中优势种群为：青霉属Penicillium、镰孢霉属Fusarium、曲霉属Aspergillus和木霉属Trichoderma，其数量分别占分离真菌总数的18.3%、13.2%、6.7%和6.6%。

图 2　不同地区优势菌属分离频率Fig. 2　Isolated frequency of dominant fungi in different areas注： 1：青霉属Penicillium； 2：镰孢霉属Fusarium； 3：曲霉属Aspergillus； 4：木霉属Trichoderma； 5：疫霉属Phytophthora； 6：毛霉属Mucor； 7：腐质霉属Humicola； 8：腐霉属Pythium； 9：枝顶孢属Acremonium； 10：胶盘孢属Hainesia； 11：笄霉属Choanephora； 12：粘帚霉属Gliocladium； 13：拟青霉属Paecilomyces； 14：褐孢霉属Fulvia； 15：瓶霉属Phialophora。

3结论与讨论

本实验首次对我国主要花生产区根际土壤真菌区系及多样性进行研究，共分离鉴定出21个属真菌，其中优势属为青霉属(Penicillium)、镰孢霉属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)。花生根际土壤分离到的真菌中有7个属为常见花生病害致病菌，镰孢霉属(Fusarium)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、轮枝孢属(Verticillium)、疫霉属(Phytophthora)、腐霉属(Pythium)等。优势种类因其数量较大，对真菌群落的结构和群落环境的形成有明显的影响作用，对花生生长发育也有一定的影响。真菌的多样性及优势种群也反映了真菌的生物学特性以及真菌和寄主植物与其他生态因素的相互关系。分离鉴定出的真菌中，有相当数量的具有生防潜力的木霉属及粘帚霉属等存在，尤其是木霉属的真菌在防治花生土传病害方面有着很大的潜力。

由于我国幅员辽阔花生种植区土壤的理化性质、环境、气候等存在很大的差别，这种状况必然会引起土壤真菌的种类和数量差异。另外，相当一部分真菌在人工培养基条件下不产生繁殖结构或子实体，或继代培养后丧失产孢能力，故有些土壤真菌还不能完全分离。因此，虽然本研究基本明确了我国花生主产区花生根际土壤中真菌的种类，但还不能完全显示其土壤真菌的多样性、种群分布及区系，有待于结合分子生物学技术进行更深入研究。

参考文献：

[1] 戴芳澜. 中国真菌总汇[M]. 北京：科学出版社，1979.

[2] 邓叔群. 中国的真菌[M]. 北京：科学出版社，1963.

[3] 方中达. 植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社,1997.

[4] 梁晨，吕国忠. 土壤真菌分离和计数方法的探讨[J]. 沈阳农业大学学报，2000,31(5)：515-518.

[5] 陆家云. 植物病原真菌学[M]. 北京：中国农业出版社，2001.

[6] 魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979.

Analysis of Classification of Soil Fungi in Main Peanut Production Areas in China

LI Ai-jun, YAO Yan-po*, ZHANG Li-tian, XIAO Jin, ZHOU Xin, ZHANG Xin,XIANG Ai-li, ZHANG Jian-min, DONG Li-xue

(LivestockandAquaticProductsQualityInspectionandTestCenter/DepartmentofAgr.ProductQualitySafetyRiskAssessmentExperimentStation,Tangshan063000,China)

Abstract:In the study, 1255 fungal strains were isolated from 105 peanut soils collected from 15 countries in 10 provinces of China. These fungi have been identified to 21 genera, using the method of microscopical observation according to morphology. 2 genera belong to Oomycetes, 3 genera belong to Ascomycota and 16 genera belong to mitosporic fungi. In these soils, the dominant species were Penicillium, Trichoderma and Fusarium, accounting for 28.89%,14.16%and 8.64%, respectively.

Key words:peanut; soil; fungi; diversity; identification

中图分类号：S565.2; S154.37

文献标识码：A

作者简介：李爱军(1979-)，男，河北唐山人，唐山市畜牧水产品质量监测中心副研究员，主要从事农产品质量安全研究。*通讯作者：姚彦坡(1977-)，男，博士，高级农艺师，主要从事粮油产品质量安全、产毒真菌防控及微生态学研究。E-mail: yao7707@126.com

基金项目：国家农产品质量安全风险评估重大专项(GJFP201500704)；农业部生物毒素检测重点实验室开放课题

收稿日期：2015-12-22

DOI：10.14001/j.issn.1002-4093.2016.01.004