桂花病害的种类调查和病原鉴定

顾焕先，张国辉，佀胜利

（1.凯里市林业局森林植物防治检疫站，贵州凯里 556000；2.凯里学院环境与生命科学分院，贵州凯里 556011）



桂花病害的种类调查和病原鉴定

顾焕先1，张国辉2，佀胜利2

（1.凯里市林业局森林植物防治检疫站，贵州凯里 556000；2.凯里学院环境与生命科学分院，贵州凯里 556011）

摘 要：根据贵州省麻江县桂花的病害发生现状，通过林间调查法和组织分离法对病害进行调研，采用ITS保守序列测序和形态学鉴定的方法对致病的病原菌进行分类鉴定。结果表明，病原菌为木樨生叶点霉（Phyllosticta osmanthicola）和胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide），其导致的真菌病害分别为桂花叶枯病和炭疽病。

关键词：桂花；木樨生叶点霉；胶孢炭疽菌

文献著录格式:顾焕先，张国辉，佀胜利.桂花病害的种类调查和病原鉴定［J］.浙江农业科学，2016，57（6）: 888-890.

桂花（Osmanthusfragrans）别名木樨、九里香、岩桂，为木樨科木樨属常绿灌木或小乔木，既是优良的园林绿化树种，又是著名的香料植物和药用植物［1］。由于病害可降低基地内桂花的观赏价值，也对其生长造成较大影响。本调查研究根据麻江县国之魂绿业科技基地的桂花病害发生现状，采用组织分离法和ITS保守序列测序对病害进行调研，为当地种质资源的保护提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

室外病害调查。于2015年9月在贵州省黔东南州麻江县国之魂绿业科技基地进行标本采集，记录病害发生的特点和症状，并采集新鲜标本用于病原分离和鉴定。

室内试验。在凯里学院微生物实验室进行。病害标本采集于贵州省黔东南州麻江县国之魂绿业科技基地。供试培养基为PSA培养基。

1.2 方法

观察并描述发病部位的病斑形态、颜色、大小及为害程度等，同时对发病部位进行拍照。采用组织分离法和切片法对发病叶片进行病原菌分离，切取病组织3块，25℃下倒置培养5～7 d。对菌落进行分离纯化，直至获得纯培养。再在显微镜下对病原菌进行镜检拍照，并对菌丝和孢子大小进行测量、记录。采用形态学鉴定和ITS保守序列测定对致病的病原微生物进行分类鉴定。根据测序结果，将菌株的ITS-rDNA序列与NCBI的GenBank数据库中已知序列进行序列比对与同源性分析，结合病原菌形态学鉴定结果，最终确定病原菌种类。

1.3 病原回接

纯化后的致病菌于PSA培养基上培养3～4 d，用无菌水洗下，配制成浓度为106个·mL-1的孢子悬浮液，采用针刺法接种。发病后，再从病斑上分离病原菌并鉴定。

2 结果与分析

2.1 桂花叶枯病

2.1.1 发病症状

主要为害桂花的叶片，由叶尖开始发病，沿着叶柄方向扩延，病部出现黄褐色的不规则形大病斑，病健交界明显，发病严重时，整个叶尖全发病，叶面变褐坏死，后期可在病斑上产生黑色小点（图1中a）。

2.1.2 病原鉴定

分生孢子器大小为108.15～165.41 μm，球形，（图1中b）。分生孢子圆形，无色，1～2 μm（图1中c）。采用ITS保守序列测序和形态学鉴定的方法对致病的病原微生物进行分类鉴定表明，病原菌为木樨生叶点霉（Phyllosticta osmanthicola）。

图1　桂花叶枯病症状（a）、病原菌木樨生叶点霉的分生孢子器（b）和孢子（c）

2.2 桂花炭疽病

2.2.1 发病症状

主要为害桂花叶片，多由叶缘和叶面发病，叶面首先出现褪绿小斑点，病斑逐渐扩大，呈圆形、半圆形或椭圆形。病斑边缘有红褐色，中央浅褐色至灰白色，发病处病健交界明显。发病严重时可导致桂花叶片的坏死脱落（图2中a）。

2.2.2 病原鉴定

分生孢子长圆柱形，两端钝圆，单孢，内多有2个油球，孢子大小为9.99～30.38 μm×3.55～7.21 μm，采用ITS保守序列测序和形态学鉴定的方法对致病的病原微生物进行分类鉴定，结果表明，病原菌为胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioide）（图2中b）。

图2　桂花炭疽病症状（a）和病原菌胶胞炭疽菌（b）

2.3 病原回接结果

采用针刺法用孢子悬浮液接种3 d后，桂花叶片发病，再从病斑上采用组织分离法分离病原菌并鉴定，结果表明分离菌株与以上接种菌株相同，根据柯赫氏法则，证明接种菌株为病害的致病菌木樨生叶点霉和胶胞炭疽菌。

3 讨论

本研究通过组织分离法和致病性测定获得致病菌，结合形态学鉴定的方法和ITS保守序列测序，最终确定病原菌的分类地位，以期为今后进行贵州省黔东南州麻江县国之魂绿业科技基地桂花的病害防控提供参考依据。桂花经常受到很多病菌的侵染而表现生长不良甚至死亡，目前已研究和记载的桂花病害主要包括:桂花炭疽病和桂花叶尖皱缩病是胶胞炭疽菌引起［2-3］；桂花枯斑病由木樨生叶点霉引起［4］；桂花褐斑病由木樨生尾孢（Cerospora osmanthicola）引起［5］；桂花紫纹羽病由紫卷担菌（Hlicobasidium perpueum）引起［6］；桂花煤污病由巴特勒小煤炱（Meliola butleri）、刺盾炱（Chaetothyrium spinigerum）和柑橘煤炱（Capnodiumcitri）引起［7］；桂花藻斑病由头孢藻（Cephaleurosvirescens）引起［8］；桂花根结线虫病由南方根结线虫（Meloidogynearenaria）引起及桂花叶枯病由链格孢菌［Alternaia alternata（Fr.）Keissler］和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）引起［9-13］。

目前，贵州省对桂花病害的调查研究较少，为了解黔东南州桂花病害的基本情况，本研究对贵州省黔东南州麻江县国之魂绿业科技基地桂花进行调研，以期明确当地桂花发病的病害种类。结果表明，当前桂花的主要致病菌为木樨生叶点霉和胶胞炭疽菌，其引起的病害为叶枯病和炭疽病。桂花炭疽病是为害性较大的病害，其发生严重时可造成桂花叶片的枯死、脱落甚至可导致整个树体的死亡，严重影响桂花的经济价值和观赏价值。炭疽病的病原菌以分生孢子盘在病落叶中越冬，由风雨传播［14］。炭疽病在各个桂花种植地均有发生。

值得注意的是，木樨生叶点霉引起的叶枯病在已发表的相关论文中表述有所不同。目前已报道的主要有细极链格抱菌可导致叶枯病，木樨生叶点霉引起的桂花枯斑病，木樨生叶点霉引起的叶斑病［15］。由此可见，不同地区和时间桂花叶枯病的致病菌和病害命名均有差异。故须结合组织分离法进行病害鉴定和分析。本研究中采用形态学和ITS序列分析分子鉴定的方法，鉴定出桂花叶枯病的致病菌，具有一定的科研价值和参考意义。

4 小结

针对根据贵州省麻江县桂花的病害发生现状，采用林间调查法和组织分离法对病害进行调研，ITS保守序列测序和形态学鉴定的方法对致病的病原菌进行分类鉴定，结果表明，病原菌为木樨生叶点霉和胶胞炭疽菌，其导致的真菌病害分别为桂花叶枯病和炭疽病。本次的研究结果具有一定的科研价值，为保护贵州省黔东南州麻江县国之魂绿业科技基地的重要林木种质桂花资源提供了较好的科学依据和技术支持。

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（责任编辑：张瑞麟）

中图分类号：S435.671

文献标志码：A

文章编号：0528-9017（2016）06-0888-02

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160629

收稿日期:2016-02-15

基金项目:贵州省教育厅项目（黔教合人才团队字［2014］48）

作者简介:顾焕先（1973—），男，贵州凯里人，工程师，本科，主要从事森林植物防治检疫工作，E-mail: 410727748@qq.com。

通信作者:张国辉（1978—），副教授，E-mail: 59833259@qq.com。