葡萄糖调节蛋白78和蛋白质二硫键异构酶在肝癌细胞内质网应激前后的表达*

李利波， 陈腾祥*, 潘　娅*

(贵州医科大学 生理学教研室， 贵州 贵阳　550004)

葡萄糖调节蛋白78和蛋白质二硫键异构酶在肝癌细胞内质网应激前后的表达*

李利波**， 陈腾祥***, 潘娅***

(贵州医科大学 生理学教研室， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨正常肝细胞和肝癌细胞在诱导发生内质网应激(ERS)前后细胞裂解液中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白质二硫键(PDI)、的表达水平。方法： 取培养获得的第3代正常肝细胞LO-2和肝癌HepG2与SMMC-7721细胞，采用150 mmol/L无水乙醇处理48 h诱导发生ERS；分别提取3种细胞裂解液中蛋白质，采用Western blot方法检测GRP78和PDI表达水平。结果： 在ERS前,GRP78在HepG2细胞中表达最高，其次为SMMC-7721细胞，在LO2细胞中表达最低，3种细胞GRP78表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.001)；诱导细胞发生ERS后，HepG2细胞及LO2细胞GRP78表达均上调，而SMMC-7721细胞GRP78表达下调，分别与相应细胞发生ERS前比较，差异有统计学意义(P<0.05)；在ERS前,PDI的表达在SMMC-7721细胞中最高，其次LO2细胞，在HepG2细胞中表达最低,3种细胞比较，差异有统计学意义(P<0.001)；诱导发生ERS后，与ERS前相对应细胞比较，3种细胞的PDI表达水平均下调，差异有统计学意义(P<0.05)。结论： ERS后，肝癌SMMC-7721和HepG2细胞裂解液中的GRP78表达水平发生变化，PDI表达降低。

[关键词]癌，肝细胞； 内质网应激； 蛋白质二硫键异构酶； 葡萄糖调节蛋白78

内质网是真核细胞中适应性最强的细胞器，内质网应激(ERS)是指在多种病理或生理因素的干扰下，内质网稳态被打破，发生错误折叠和未折叠蛋白质在内质网腔内聚集，并引起Ca2+平衡紊乱[1]。ERS主要包括未折叠蛋白反应(UPR)、内质网超负荷反应(EOR)和固醇调节级联反应(SREBP)，研究认为癌症相关的病理与内质网稳态的失衡与诱导ERS和UPR途径有关[2-5]。蛋白质二硫键异构酶(PDI)是内质网中一种重要的蛋白质折叠催化剂，可帮助新合成的蛋白质重新形成二硫键并产生正确折叠的构象。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是内质网中的一种结合蛋白，可增强肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，被视为肿瘤治疗反应的一种生物标志物[6]。原发性肝癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，在我国的发病率和死亡率占全球的50%[7]。本研究通过观察PDI、GRP78在正常肝细胞LO2、肝癌细胞HepG2及SMMC-7721中的表达水平，了解ERS在原发性肝癌发生及发展中的作用。

1材料与方法

1.1细胞及试剂

正常肝细胞LO2、肝癌HepG2细胞株和肝癌SMMC-7721细胞株购买于上海生命科学研究所，BCA Protein Assay KitP0010S、RIPA裂解液(强)P0013B购买于上海碧云天公司,RIPA裂解液 WB-0071、NP-40裂解液购买于上海鼎国生物生物技术有限公司，Prestained protein marker 00161543、ECL-PLUS/KitM3121/1859022购买于thermo公司。医用X光片038401501购买于carestream公司，X线胶片显影粉及定影粉购买于上海冠龙照像材料厂；稳压电源(电泳用)EPS-300，SDS-PAGE蛋白电泳仪 VE-180，蛋白转膜仪VE-186为上海天能公司产品。冷冻高速离心机fresco 21购买于thermo公司,PVDF膜 IPVH00010购买于millipore公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养人正常肝细胞LO2及肝癌细胞系HepG2用DMEM+10%胎牛血清，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养，为贴壁生长，培养1周后传代至第3代。人肝癌细胞系SMMC-7721细胞用RMPI1640+10%胎牛血清、37 ℃、含5% CO2细胞培养箱中培养，为贴壁生长，首次传代23 d，2周后传代至第3代。

1.2.2诱导ERS用150 mmol/L无水乙醇分别处理培养获得的第3代HepG2、SMMC-7721及L-02细胞48 h，弃去无水乙醇，PBS洗涤2次，获得发生ERS后的3种细胞标本。

1.2.3检测GRP78蛋白及PDI蛋白表达用Western Blot方法，分别提取培养获得的3种细胞样品，PBS洗涤两次后刮下细胞转移入EP管中，用预冷的2×Lysis Buffer裂解，冰上裂解10～15 min后超声破碎细胞，离心15 min，取上清液提取蛋白样品。根据GRP78或PDI的蛋白分子量制胶，样品上样，恒压80 V、电泳2 h、在4 ℃及300 mA恒流条件下电转150 min，将蛋白转移到PVDF膜上，用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1 h 、4 ℃过夜；TBST洗膜3次、每次10 min，然后显色。将胶片进行扫描、拍照，用凝胶图像处理系统分析目标条带的分子量和净光密度值。

1.3统计学处理

分别检测用无水乙醇处理前后3种细胞裂解液中的GRP78及PDI表达，用SPSS 21软件进行统计分析，采用one-way ANOVA法、重复测量方差分析法分析3种细胞中这两种蛋白质在无水乙醇处理前后表达水平的差异。P<0.05为差异有统计学意义

2结果

2.1GRP78表达

在给予无水乙醇应激处理前，GRP78在HepG2细胞中表达最高，其次为SMMC-7721细胞，在LO2细胞中表达最低，3种细胞之间GRP78的表达比较，差异有统计学意义(P<0.001)。经无水乙醇处理48 h后，HepG2细胞及LO2细胞GRP78表达均上调，而SMMC-7721 ERS后GRP78表达下调,分别与相应细胞无水乙醇处理前比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示经无水乙醇处理48 h后3种细胞均发生了ERS。见图1、表1。

(1)与无水乙醇处理前比较，P<0.05图1　无水乙醇处理前后3种细胞中GRP78表达Fig.1　The expression of GRP78 in three kinds of cells before and after ethanol treatment

细胞光密度值处理前处理48hPLO20.73±0.381.05±0.54<0.05HepG20.90±0.141.17±0.17<0.05SMMC-77210.74±0.370.08±0.04<0.05

2.2PDI表达

在给予无水乙醇应激处理前PDI的表达在SMMC-7721细胞中最高，其次LO2细胞，在HepG2细胞中表达最低，3种细胞之间PDI的表达比较，差异有统计学意义(P<0.001)。在无水乙醇处理48 h后3种细胞的PDI的表达水平均下调，与ERS前相对应细胞的PDI表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2及表2。

(1)与无水乙醇处理前比较,P<0.05图2　无水乙醇处理前后3种细胞中PDI表达Fig.2　The expression of PDI in three kinds of cells before and after ethanol treatment

细胞光密度值处理前处理48hPLO20.93±0.100.57±0.640.049HepG20.80±0.280.47±0.240.003SMMC-77211.20±0.281.00±0.290.032

3讨论

内质网是细胞内蛋白质合成、折叠、组装、运输和参与脂质代谢的重要场所，也是细胞内储存Ca2+的主要场所,细胞有一套完整的机制来监督和帮助内质网内蛋白质的折叠与修饰。当某些细胞内外因素导致内质网生理功能发生紊乱，出现ERS的一系列反应，包括某些蛋白质质折叠能力增强、某些蛋白质翻译停滞、某些蛋白质的降解加速、或细胞内Ca2+紊乱等。

GRP78是热休克蛋白70家族成员之一。GRP78在内质网中有两个作用：(1)促进进入内质网的未折叠蛋白质的疏水氨基酸结合，防止多肽链不正确的折叠和聚合，还可识别错误折叠的蛋白质或未装配好的蛋白质亚单位、并促进他们重新折叠和装配；(2)防止新合成的蛋白质在转运过程中变性或断裂。研究认为，GRP78可增强肿瘤细胞的增殖、侵袭能力，其水平变化被视为肿瘤治疗反应的一种生物标志[8],也有报道证实GRP78在肿瘤细胞内质网应激反应中扮演主要角色[9]。本研究显示在诱导ERS前，GRP78在HepG2细胞裂解液中表达最高，其次为SMMC-7721细胞，在LO2细胞中表达最低，表明GRP78在正常肝细胞中具有一定水平，但肝细胞发生恶性改变时GRP78表达升高，且在低转移能力的HepG2细胞中表达较高，而高转移、高侵袭性的SMMC-7721中表达较低。这提示ERS时GRP78表达水平可能与肝癌细胞的恶性生物学特性有关，但ERS与肝癌细胞的恶性生物学特性的因果关系值得进一步研究。本实验表明，在诱导ERS后，与诱导前比较，GRP78在HepG2细胞中上调最多，LO2细胞次之，SMMC-7721则是下调，分别与发生ERS前3种细胞比较，差异有统计学意义(P<0.05)，这表明诱导ERS后，内质网内GRP78的表达发生了改变，提示细胞内蛋白质的合成过程受到了影响。而3种细胞诱导ERS后，GRP78在LO2细胞中改变最小，在两种肝癌细胞中改变较大，提示正常肝细胞与肝癌细胞在发生ERS时的反应是不一样的，肝癌细胞反应程度高于正常肝细胞，且在低转移能力的HepG2细胞中改变较在高转移、高侵袭性的SMMC-7721细胞改变小，这也提示ERS可能与肝癌的恶性生物学特性相关。这种相关性值得扩大标本量进一步探讨。

PDI是一种定位于内质网管腔的多功能分子伴侣，它同时具有氧化还原酶活性。PDI能识别未折叠或部分折叠的新生肽折叠中间物，通过与其多肽结合部位结合，防止靶蛋白和底物蛋白之间错误的结合或聚合；PDI还能催化蛋白质分子中二硫键的形成，ERS可以诱导PDI进入细胞质[10]。在本研究中，ERS前PDI的表达在SMMC-7721细胞中最高，其次LO2细胞，在HepG2细胞中表达最低，3种细胞之间PDI的表达比较，差异有统计学意义(P<0.001)，表明PDI在正常肝细胞中具有一定水平，肝细胞发生恶性改变时PDI表达异常，高转移、高侵袭能力的SMMC-7721肝癌细胞裂解液中的PDI表达高于低转移能力的HepG2细胞，P<0.001，似乎提示PDI表达水平可能与肝癌细胞的恶性生物学特性有关，但PDI与肝癌细胞的恶性生物学特性的因果关系值得进一步研究。在诱导ERS后，与诱导前比较，PDI在3种细胞裂解液中的表达均下调，与应激前PDI 表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，这表明诱导ERS后，内质网内PDI的表达发生了改变。这些改变将影响细胞内二硫键的形成过程。但3种细胞之间PDI表达水平下调比较，差异无统计学意义(P>0.05)，似乎提示ERS后PDI表达水平与肝癌细胞的恶性生物学特性无关，本研究样本量较小，可进一步扩大标本量探讨。

本研究显示，在ERS前，PDI在高转移、高侵袭能力的SMMC-7721肝癌细胞及低转移能力的HepG2细胞裂解液中的表达与GRP78在两种细胞中的表达正好相反。在ERS后，PDI在两种肝癌细胞中的表达均下调，而GRP78在HepG2细胞中上调，SMMC-7721则是下调，提示不同转移能力的肝癌细胞在发生ERS后，内质网内相关蛋白质表达水平的变化方向既可以相同、也可以相反，这些变化与肝癌细胞的恶性生物学特性的关系，还有待研究。

4参考文献

[1] kaufman RJ.Orchestrating the unfolded protein response inhealth and disease[J].J Clin Invest, 2002(10):1389-1398.

[2] Xu Y, Chiu LF, He QY, et al. Tubeimoside-1 exerts cytotoxicity in Hela cells through mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress pathways [J]. J Proteome Res, 2009(3): 1585-1593.

[3] Mujcic H, Rzymski T, Rouschop KM, et al. Hypoxic activation of the unfolded protein response (UPR) induces expression of the metastasis-associated gene LAMP3[J]. Radiother Oncol, 2009(3): 450-459.

[4] Hung JY. Oxidative and endoplasmic reticulum stress signaling are involved in dehydrocostuslactone mediated apoptosis in human non-small cell lung cancer cells [J]. Lung Cancer, 2009(10)：1016.

[5] Sun SY, Liu XG, Zou W, et al. The farnesyltransferase inhibitor lonafarnib induces CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein-dependent expression of death receptor 5, leading to induction of apoptosis in human cancer cells[J]. Biol Chem, 2007(26): 18800-18809.

[6] Li J, Lee AS.S tress induct ion of GRP78/ BiP and it s role in can cer[ J ]. Curr Mol Med, 2006(1) :45-54.

[7] 刘慧春.中国原发性肝癌治疗指南解读[J].肝胆外科杂志， 2013(1):12-14.

[8] Robinson A,HinesV,EidenK,et al．Protein disfideisomerase over expression increase secretion of foreign protein in sac-charomycescerevisiae.Biotechnology, 1994(2):381-384.

[9] Gilbert HF,Protein disulfide isomerase.Methods Enzymes, 1998(1):26-50.

[10]Hsu TA,Watson S, Eiden JJ,et al．Rescue of immunoglobulins from insolubility is facilitated by PDI in the baculovirus expression system.ProteinExprPurif, 1996(2):281-288.

(2016-03-15收稿，2016-05-26修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 赵毅

Expression of PDI and GRP78 before and after ERS in Liver Cancer Cells

LI Libo, CHEN Tenxiang, PAN Ya

(DepartmentofPhysiologyGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To investigate the expression level of PDI and GRP78 before and after ERS in the cell lysates of normal liver cells and liver cancer cells. Methods: The third-generation cultivated LO-2, HepG2 and SMMC-7721 cells were processed by 150 mmol/ L anhydrous ethanol for 48 h to induce ERS. Then respectively extracted the proteins in three kinds of cell lysis liquid, then adopting Western blot method to detect the expression level of GRP78 and PDI. Results: Before the ERS, the expressing of GRP78 in HepG2 cells was the highest, secondly was SMMC-7721 cells, the expressing of GRP78 in LO2 cells was the lowest. To compare the expression of GRP78 in three kinds of cells, differences were statistically significant (P<0.001). Before ERS, the expression of PDI in SMMC-7721 cells was highest, followed by LO2 cells, the expression in HepG2 cells was the lowest. To compare the expression of three kinds of cells, differences were statistically significant(P<0.01). After induced ERS, all of the expression of PDI in three cells were downregulating, differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion: After ERS, the expression levels of GRP78 changed in SMMC-7721 and HepG2 cells lysis liquid, expression level of PDI decreased.

[Key words]carcinoma hepatocellular; endoplasmic reticulum stress; protein disulfide isomerase; glucose regulated protein 78

*[基金项目]贵州省科技厅科研基金黔科合[LG(2011)208号; 贵州省教育厅自然科学研究基金黔教科[(2008)022号]

[中图分类号]R735.7； R341

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)06-0667-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.011

**贵州医科大学2016届硕士研究生，工作单位贵州省人民医院肿瘤科

***通信作者 E-mail:gzctxin@qq.com; gypanya@126.com

网络出版时间：2016-06-16网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1703.032.html