FZD3基因和蛋白在大肠癌中的表达*

何　婉， 成志强， 黄思铨， 许瑞莲， 谭文勇， 黄凯斌， 钟克力， 陈亦欣， 陈明乐， 傅宇翔， 夏利刚**

(1.暨南大学第二临床医学院， 深圳市人民医院， 广东 深圳　518020； 2.香港理工大学， 香港； 3.香港中文大学， 香港)

FZD3基因和蛋白在大肠癌中的表达*

何婉1， 成志强1， 黄思铨2， 许瑞莲1， 谭文勇1， 黄凯斌1， 钟克力1， 陈亦欣1， 陈明乐3， 傅宇翔1， 夏利刚1**

(1.暨南大学第二临床医学院， 深圳市人民医院， 广东 深圳518020； 2.香港理工大学， 香港； 3.香港中文大学， 香港)

[摘要]目的： 探讨WNT信号通路受体FZD3mRNA及蛋白在大肠癌细胞及组织中的表达。方法: 取正常大肠细胞株CCD18-Co、大肠癌细胞株SW480和SW620，以WNT信号通路PCR芯片筛选大肠癌细胞株中差异性表达的基因，并选择FZD3基因采用Taqman PCR法进行验证其在大肠癌细胞中的高表达，同时比较FZD3蛋白在大肠癌组织、腺瘤组织及癌旁正常组织的表达。结果: 与大肠正常细胞株CCD18-Co比较，19个基因在大肠癌细胞株SW480和SW620中表达上调，其中FZD3基因为CCD18-Co的195倍和105倍；验证结果显示，与大肠正常细胞株CCD18-CoFZD3比较， FZD3 mRNA在SW480和SW620细胞株中较中升高820倍和622倍，验证了FZD3 mRNA在大肠癌细胞株中的高表达；免疫组化结果显示，FZD3蛋白在大肠癌组织中表达为100%，大肠腺瘤中的表达为88%，而癌旁正常组织中仅为17.5%，与癌旁正常组织相比，FZD3蛋白在大肠癌组织中免疫组化分数高6.6倍(P<0.01) ； FZD3蛋白的高表达与肠癌TNM分期显著相关(P<0.005) 。结论： FZD3可能在大肠癌的发生、发展中起到潜在癌基因的作用。

[关键词]FZD3基因；WNT信号通路；大肠；肿瘤；PCR芯片；免疫组织化学；TNM分期

WNT信号通路在大肠癌致瘤过程中通过WNT配体结合Frizzled(FZD)受体，引起核β-catenin的转录活动，从而促进肿瘤细胞生长。以上称为WNT信号通路的经典通路[1]。WNT信号通路还包括非经典通路及平面细胞极性通路[2]。人类FZD3基因编码WNT配体的受体，在FZD基因家族的10个成员中，FZD3定位于8号染色体短臂21位点，高表达于中枢神经系统区域、睾丸、肾脏、子宫、前列腺和骨骼肌，而RT-PCR或northern杂交检测FZD3在其他正常人类组织低表达[3]。FZD3被认为是多功能的蛋白，它既可在经典WNT/β-catenin途径又可在非经典的WNT途径甚至PI3K-AKT途径起作用[4]。相对于来自于人外周血中正常B细胞， 定量PCR方法检测到FZD3 mRNA的表达在慢性淋巴细胞白血病细胞中升高[5]。乳腺癌中，FZD3基因联合其他5种基因(ITGB5，M-RIP，MMP16，RDX和RhoA)是负向预后指标，以特异性siRNA 敲减FZD3基因可降低乳腺癌细胞株MDA-MB-231的侵袭和迁移能力[6]。肝癌细胞中，FZD3，6,7常常高表达，与活化的FZD依赖的包括经典β-catenin 途径和非经典PKC和JNK瀑布的信号通路相关[7]。更显著的是，大肠癌细胞株中FZD3 mRNA 强烈表达，且在46%的家族性腺瘤性息肉(FAP)和67%散发性结肠腺瘤中检测到FZD3 mRNA的表达，表明FZD3在大肠癌的成瘤过程中起到关键的作用[8]。然而大肠癌中FZD3基因和蛋白的表达模式尚不清楚，且表达的意义值得进一步探索。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂RPMI-1640、胎牛血清购于美国Gibco公司，Trizol试剂购于美国Invitrogen公司、Qiagen试剂盒购自德国Roche公司；TaqMan 逆转录试剂、FZD3特异性引物(Hs00907279_m1)、内参照GAPDH特异性引物 (Hs99999905_m1)和TaqmanMGB探针购自美国Life technologies公司，人类WNT signaling pathway RT2 ProfilerTMPCR Array及逆转录试剂盒RT2 First Strand Kit (#C-03)购于德国QIAGEN公司。

1.1.2细胞株人类大肠癌细胞株SW480、SW620和正常大肠细胞株CCD18-Co购买自美国ATCC公司(http://www.atcc.org/)，细胞常规培养于含100 ml/L 胎牛血清的RPMI-1640 (#31800-022;Invitrogen Corporation,CA,USA)完全培养液中， 37 ℃、5%的CO2饱和湿度培养箱内培养，稳定传代后至指数增长期用于实验。

1.1.3大肠癌组织从香港伊丽莎白医院病理科收集福尔马林固定、石蜡包埋的40例大肠癌组织及41例大肠腺瘤组织。大肠癌患者中男性25例(62.5%)，女性15例 (37.5%)，中位年龄59岁。根据美国癌症联合会(AJCC)的标准：Ⅰ期5例 (12.5%)为，Ⅱ期13例 (32.5%),Ⅲ期14例 (35.0%)及Ⅳ期8例 (20.0%)。研究获得医院伦理委员会审核，患者签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1大肠癌细胞中人类WNT信号通路中高表达基因的筛选采用人类WNT signaling pathway RT2 ProfilerTMPCR Array筛选，取SW480、SW620及CCD18-Co单层细胞，采用Trizol裂解细胞，提取总RNA，NanoDrop分光光度计测定总RNA的浓度及纯度；取2 μg总RNA，根据逆转录试剂盒the RT2 First Strand Kit (#C-03)说明书进行逆转得到cDNA。25 μL PCR Array反应体系包括 cDNA、2×SABiosciences RT2 qPCR反应混合液和水，反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火/延伸 1 min，共40个循环，计算每孔达到阈值的循环数(Ct)。采用2-ΔΔCt法分析结果，重复检测3次。按以下公式计算各转移相关基因mRNA相对表达量：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=ΔCt对照组-ΔCt试验组，F =2-ΔΔCt。根据比较结果，选出WNT信号通路中高表达基因为FZD3。

1.2.2验证大肠癌细胞中FZD3 mRNA表达采用实时定量PCR法，取1.2.1提取的总RNA 2 μg，采用TaqMan 逆转录试剂将RNA逆转录为cDNA。20 μL PCR反应系统包括20×TaqMan®基因表达预混液1 μL， TaqMan®统一预混液10 μL，水7 μL及cDNA 2 μL。50 ℃扩增2 min，95 ℃预变性 10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火/延伸1 min,共40个循环。计算每个孔的达到阈值的循环数(Ct)。按1.2.1项下方法进行结果分析。

1.2.3大肠癌组织中FZD3蛋白表达采用免疫组织化学法，大肠癌组织石蜡切片在二甲苯中脱蜡，分别经100%、95%和70%乙醇再水化，最后在蒸馏水中洗涤。抗原修复及与FZD3抗体(1∶100稀释)结合的过程在Ventana BenchMark XT 自动染色机上完成，室温孵育约1 h 32 min，采用媒染二氨基联苯沉积物DAB检测蛋白表达；玻片以苏木精复染，经70%、95%及100%乙醇中脱水，最后加载盖玻片。不加一抗作为阴性对照。由二位病理医师独立盲评结果并计分，400倍放大倍数取5个视野进行评估得分。IHC评分=阳性细胞百分比×染色强度[9]。

1.3统计学处理

2结果

2.1大肠癌细胞株中高表达基因的筛选

PCR芯片结果显示, 与大肠正常细胞株CCD18-Co比较，19个基因在大肠癌细胞株SW480和SW620中表达上调，其中FZD3基因的表达在SW480和SW620细胞中较在CCD18-Co中为195倍和105倍，见表1。

表1　WNT信号通路芯片中大肠癌细胞株SW480和SW620中的高表达基因

2.2FZD3 mRNA在大肠癌细胞中的高表达验证

Taqman探针PCR法验证FZD3 mRNA在大肠癌细胞株中的表达。结果显示，与大肠正常细胞株CCD18-CoFZD3比较， FZD3 mRNA在SW480和SW620细胞株中较中升高820倍和622倍，验证了Sybr Green PCR 芯片检测到的FZD3 mRNA在大肠癌细胞株中的高表达，见图1。

2.3FZD3蛋白在大肠癌组织中的表达

免疫组化结果显示，FZD3蛋白在大肠癌组织中表达为100%，大肠腺瘤中的表达为88%，而癌旁正常组织中仅为17.5%(图2)。与癌旁正常组织相比，FZD3蛋白在大肠癌组织中免疫组化分数高6.6倍(P<0.01) ，见图3。FZD3蛋白的高表达与肠癌TNM分期显著相关(P<0.005) ，见图4。

图1　FZD3 mRNA在大肠癌细胞株中高表达验证 Fig.1　Validation of FZD3 mRNA over-expression in CRC cell line

A为癌旁正常组织，B为大肠腺瘤组织，C为大肠癌组织图2　FZD3蛋白在大肠癌及大肠腺瘤组织中的表达Fig.2　Expression of FZD3 protein in colorectal carcinoma and colorectal adenoma

图3　石蜡组织切片上FZD3染色的IHC评分Fig.3　IHC score of FZD3 staining on paraffin sections

图4　不同TNM分期大肠癌患者组织中ZD3 蛋白表达IHC评分Fig.4　IHC score of protein expression in the tissues of patients with colorectal cancer in different TNM staging

3讨论

经典WNT信号通路的激活在大肠癌的发展中起主导作用。本研究结果显示包括AXIN1,NKD1,PORCN,WNT10A,WNT3,WNT6,FZD3,FZD5, CTNNB1(β-catenin), CTNNBIP1和TCF7在内的11个经典WNT信号通路基因在SW40和SW620 中表达增高，其中β-catenin的表达是WNT信号通路生理性或异常激活的标志, 同时WNT信号靶基因MYC在2种大肠癌细胞株中亦表达增高，至少部分因为经典WNT/ β-catenin信号通路的过度激活导致[10]。除经典途径外，非经典WNT信号通路亦参与了大肠癌的发展[11]。例如WNT3和WNT6既参与经典途径又参与非经典途径，他们在SW480细胞中的高表达都曾有报道[12]，本研究结果与之相符。大肠癌细胞株SW620和SW480来自同一病人的不同病情阶段，前者取自大肠癌Duke’s C的病人1年后广泛转移至淋巴结的细胞。SW620细胞中WNT3和WNT6仍然高表达可能提示WNT信号通路仍然异常激活。

FZD3作为WNT信号通路的受体，在Ewing 肉瘤细胞中WNT诱导的神经元轴突生长中起主导作用[13]。FZD3在分化差的食管鳞状细胞癌组织中高表达[14]。本研究采用Taqman PCR方法证实大肠癌细胞株SW480和SW620较正常肠细胞株CCD18-Co高表达FZD3，仔细比较侵袭性高的SW620细胞和侵袭性较低的SW480，FZD3的表达呈降低趋势，这个现象曾在卵巢癌中报道，即发生转移的卵巢癌中表达的FZD3 mRNA水平较局限的卵巢癌中低[15]。免疫组化的结果显示，FZD3蛋白表达水平随着肿瘤的从腺瘤发展到大肠癌升高，与此相反，Caldwell等[16]发现FZD3 mRNA在11/14 (79%)大肠腺瘤中过表达，但仅仅在9/23(39%)大肠癌中过表达。另一项来自Kyoto基因及基因组百科全书(KEGG)数据库的数据也显示，大肠癌相对于大肠腺癌FZD3基因表达下降[16]。对于这种基因和蛋白表达的不一致性可能的解释是mRNA表达水平可能因为转录后、翻译或翻译后调节相关[17]。但真正原因还需进一步研究。课题组下一步还将探索同一大肠癌患者组织表达FZD3基因及蛋白的关系及潜在的机制，以期阐明FZD3促进肿瘤进展可能的信号通路。

肿瘤组织FZD3 IHC分数高于327分的患者主要是Ⅲ和Ⅳ期患者，而分数≤327主要是Ⅰ和Ⅱ期患者[9]。结合本研究结果，FZD3蛋白在患者大肠癌组织中随着临床TNM分期越晚表达越高，提示FZD3可能作为一项大肠癌有用的预后工具。课题组也将进一步比较FZD3表达和传统大肠癌生物标志物CEA的表达的关系，并试图探索FZD3蛋白在外周血的表达，寻找新的辅助预后生物学标志。

总之，FZD3基因在大肠癌细胞株中高表达，蛋白水平亦在大肠腺瘤和大肠癌中表达升高，并且具有一定的预后价值。

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(2016-03-15收稿，2016-05-29修回)

中文编辑： 刘平； 英文编辑： 刘华

Expression of FZD3 Gene and Protein in Colorectal Cancer

HE Wan1, CHENG Zhiqiang1, HUANG Siquan2, XU Ruilian1, TAN Wenyong1, HUANG Kaibin1,ZHONG Keli1, CHEN Yixin1, CHAN Mingle3, FU Yuxiang1, XIA Ligang1

(1.TheSecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople'sHospital,Shenzhen518020,Guangdong,China；2.HongKongPolytechnicUniversity,HongKong,China; 3.TheChineseUniversityofHongKong,HongKong,China)

[Abstract]Objective: To explore mRNA and protein expression of FZD3 receptor for WNT signaling pathway in colorectal cancer (CRC) cell lines and tissue and its clinical significance. Methods: Normal colorectal cell line CCD18-Co, colorectal cancer cell line SW480 and colorectal cancer cell line SW620 were selected in this study. The differentially expressed genes in colorectal cancer cell lines and normal colorectal cell line were screened by WNT signaling pathway PCR array, and FZD3 gene was chosen to validate the overexpression in CRC cell lines by using Taqman PCR assay. Meanwhile, FZD3 protein expression profile was also detected and compared between colorectal cancer tissue, adenoma tissue and adjacent normal tissue. Results: Compared with normal colorectal cell line CCD18-Co, nineteen genes up-regulated their expression in CRC cell lines SW480 and SW620, of which FZD3 gene expression was up-regulated by 195 and 105 folds in SW480 and SW620, respectively. Identification results showed compared with normal colorectal cell line CCD18-Co, FZD3 mRNA up-regulated its expression in SW480 and in SW620 by 820 folds and 622 folds, respectively. Immunohistochemical results showed that the expression of FZD3 protein in colorectal cancer tissue was 100%, the expression in colorectal adenoma was 88%, and the expression in the adjacent normal tissues was only 17.5%. There was a 6.6-fold up-regulation of FZD3 protein expression in CRC tissue compared with in adjacent normal tissue (P<0.01). The high expression of FZD3 protein was significantly correlated with the TNM staging of colorectal cancer (P<0.005). Conclusion: FZD3 may play a role in CRC tumorigenesis and development as a potential oncogene.

[Key words]FZD3 gene; WNT signaling pathway; colon; cancer; PCR array; immunohistochemistry; TNM staging

*[基金项目]深圳市卫生计生系统科研项目(201401013)

[中图分类号]R735.34

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)06-0681-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.014

**通信作者 E-mail:393322301@qq.com

网络出版时间：2016-06-16网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1632.012.html