家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞上电压门控离子通道的影响

胡朝暾，　周　熙，　肖　震

(1.怀化学院 生物与食品工程学院，湖南 怀化　418008；　2.湖南师范大学 生命科学学院，湖南 长沙　410081)



家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞上电压门控离子通道的影响

胡朝暾1,2，周熙2，肖震2

(1.怀化学院 生物与食品工程学院，湖南 怀化418008；2.湖南师范大学 生命科学学院，湖南 长沙410081)

摘要：采用全细胞膜片钳分析，测定了家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞上电压门控钠、钾和钙离子通道的影响.结果表明：粗毒对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)细胞上河豚毒素敏感型钠通道、河豚毒素不敏感型钠通道、电压门控钾通道、高电压激活钙通道和低电压激活钙通道都具有抑制作用.100 μg/mL的粗毒分别能够抑制64.0%河豚毒素敏感型钠电流、46.5%河豚毒素不敏感型钠电流、44.2%电压门控钾电流和77.7%低电压激活的钙电流.50 μg/mL的粗毒能够抑制大约74.9%高电压激活的钙电流.结果表明家福捕鸟蛛粗毒中可能存在开发为新型药物和离子通道工具试剂的毒素分子.

关键词：家福捕鸟蛛；蜘蛛毒素；膜片钳分析；电压门控离子通道；大鼠背根神经节

蜘蛛由大约4亿年前泥盆纪的蛛形纲祖先进化而来[1].其毒腺分泌毒液用于防御天敌和捕杀猎物.国内外的学者研究发现蜘蛛毒素主要是一类作用于离子通道及具有特定药理学特性的新型化合物的多肽毒素[2-4]，是天然生物毒素的一个重要来源，具有开发为神经生物学的工具试剂、治疗特定疾病的新型药物和杀虫剂的潜能[5-8].目前，国际上已发现了一些来自蜘蛛毒素可用来作为某些疾病治疗的先导分子[9].

家福捕鸟蛛(Selenocosmiajiafu)是一种生活在中国广西、云南等热带山区毒性较强的蜘蛛.该种蜘蛛最先在云南被发现[10].笔者于2012年4月份在广西宁明县发现了该种蜘蛛并对其毒素开展了初步的研究.研究发现家福捕鸟蛛粗毒中多肽和蛋白质种类丰富，从粗毒中鉴定得到了238个多肽和15种蛋白质[11].毒理学实验表明家福捕鸟蛛粗毒对小鼠的毒性较弱，主要是一类选择性作用于昆虫的蜘蛛毒素[12].作为新种蜘蛛的家福捕鸟蛛粗毒中可能包含一些具有特定药理学活性或离子通道活性的毒素分子.因此，课题组开展了家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞上电压门控离子通道活性影响的研究，希望能够筛选得到这些潜在的毒素分子.

1材料与方法

1.1家福捕鸟蛛粗毒及SD大鼠

家福捕鸟蛛采自广西宁明县桐棉乡的山地和农区，置于预先放有含水海绵的肥皂盒内活体带回湖南，室内人工饲养.家福捕鸟蛛饲养于用网状材料覆盖的塑料桶中，每日给水，每个星期喂以猪肝(切成大小约1-2 cm3的大小)、蟑螂或面包虫.采用电刺激的方法每两个星期采集毒液一次[9].毒液经冷冻干燥成白色粉末即为粗毒，放入-20℃低温存放.SD大鼠购置于湖南农业大学.

1.2溶液配制

DRG细胞培养液：称取DMEM干粉346 mg和NaHCO374 mg，溶于20 mL双蒸水后，用1 mol/L NaOH调pH至7.4，如DMEM中不含HEPES，则需按2∶1的物质的量之比加入.溶液配好后用99.9%的氧气饱和10 min左右，溶液颜色变为橙红色即可，并于37 ℃水浴预热备用.

消化液:称取胶原酶56 mg和胰蛋白酶0.66 mg，用上述充氧饱和的DMEM培养液5 mL溶解后于37 ℃预热备用.

消化抑制剂:胰蛋白酶抑制剂1.2 mg.

测定DRG细胞钠电流的细胞外液(mmol/L)：NaCl 145，KCl 2.5，CaCl21.5，MgCl21.2，HEPES 10，D-glucose 10，pH用NaOH调至7.4；电极内液(mmol/L)：CsCl 145，MgCl24，HEPES 10，EGTA 10，D-Glucose 10，ATP-Mg 2，用CsOH调节pH至7.4.

测定DRG细胞钾电流的细胞外液(mmol/L)：NaCl 150，KCl 30，CaCl25，MgCl24，TTX 0.3，HEPES 10，D-glucose 10，pH用NaOH调至7.4；细胞内液(mmol/L)：KCl 135，KF 25，NaCl 9，CaCl20.1，MgCl21，EGTA 1，HEPES 10，ATP-Na23，pH用KOH调至7.4.

测定DRG细胞钙电流的细胞外液(mmol/L)：BaCl210，tetraethylammonium Chloride 125，TTX 0.3，HEPES 10，用TEA-OH调节pH至7.4；细胞内液(mmol/L)：Cs-methane sulfonate 110，phosphocreatine 14，HEPES 10，EGTA 10,ATP-Mg 5,pH用CsOH调至7.4.

1.3大鼠背根神经节细胞急性分离和培养

选取30 d左右，体重为180-200 g的SD昆明大白鼠断颈处死，按照文献[13]的方法解剖和急性分离培养DRG细胞.

1.4膜片钳全细胞记录

图1　家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞上电压门控钠通道的影响(n=5)注：A、C分别表示对TTX-S型和TTX-R型钠电流的影响，B、D分别表示TTX-S型和TTX-R型电流-电压关系曲线

膜片钳全细胞实验在室温下进行，实验前先用对应的细胞外液更换细胞培养液.电极由抛光的玻璃电极经电极拉制仪两步拉制而成.电极入水前，给予一定的正压，使电极尖端不易被堵塞，入水电阻1.8～3 MΩ为宜.入水后进行电位补偿.在显微镜下调节微操，使电极接近细胞，当电极电阻增大0.3 MΩ左右时停止.给予持续负压，当电阻上升50 MΩ时停止，调为全细胞模式，给予-80mV的钳制电压以形成吉欧(GΩ)封接，进行快电容补偿和串联电阻补偿(补偿65%～70%).然后进行电流记录.离子通道电流经过3 kHz和10 kHz的双重过滤，采用P/4程序删除电容电流和线性漏电流.电流的记录和采集应用Pulse+Pulsefit8.0软件进行，实验结果分析采用SigmaPlot 10.0软件完成.所有数据采用平均数±标准误，n为独立实验的次数.

2结果与分析

2.1粗毒对DRG细胞电压门控钠通道活性的影响

电压门控钠通道是神经和肌肉细胞快速去极化和动作电位产生的基础，动作电位的产生首先就是钠通道电流的内流.研究发现电压门控钠通道与一些临床疾病密切相关.因此，电压门控钠通道是一些重要药物分子作用的靶位点[14].根据钠通道能否被河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)所阻断，可将钠通道分为两大类，河豚毒素敏感型(TTX-sensitive，TTX-S)和河豚毒素不敏感型(TTX-resistant,TTX-R).1 nmol/L TTX能够阻断TTX-S钠通道，当TTX浓度达到0.1 mmol/L时，TTX-R钠通道电流不能够被阻断[15].DRG细胞能够表达这两类钠通道电流.采用全细胞膜片钳技术，测定了家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞TTX-S和TTX-R钠通道的影响.首先，分别选取大直径(>35 μm)的DRG细胞和小直径(<20 μm)的DRG细胞分别记录TTX-S钠通道和TTX-R钠通道[16].实验时将膜电位钳制在-80 mV，给予脉冲宽度为50 ms，以10 mV步幅递增的去极化电压刺激引出DRG细胞钠电流.结果表明粗毒对DRG细胞上电压门控钠通道具有明显的抑制作用.100 μg/mL粗毒能够抑制64.0%±6.2%(n=5)TTX-S钠电流和能够延缓TTX-S钠通道电流的失活(图1A).另外，粗毒还改变TTX-S钠通道I-V曲线，粗毒加入后去极化电流漂移了20 mV(从-10 mV到+10 mV)(图1B).其次，也进行了粗毒对TTX-R钠通道活性的测定.选取直径小的DRG细胞记录得到钠电流，当加入200 nmol/L TTX时抑制掉TTX-S钠电流，剩下的电流为TTX-R钠电流.加入粗毒后TTX-R钠电流出现明显的抑制作用，100 μg/mL粗毒能够抑制46.5%±3.8%(n=5)TTX-R钠通道电流(图1C).粗毒对TTX-R通道电流的I-V曲线也有影响，粗毒加入后峰电压由-10 mV移到-20 mV(图1D).说明粗毒中有DRG细胞TTX-R钠通道的抑制剂.众所周知，DRG细胞表达的TTX-R钠电流主要为Nav1.8和Nav1.9电流，这两类钠通道电流也是目前研究的热点.Nav1.8被认为是和神经性疼痛相关[17]，而Nav1.9通过调节神经元的兴奋性从而与炎症反应和疼痛调节紧密相关[18].因此，粗毒中可能具有潜在的开发为镇痛活性的药物分子.

2.2粗毒对DRG细胞电压门控钾通道活性的影响

背根神经节(DRG)上表达多种钾离子通道，有电压激活钾离子通道(Kv)、钙激活的钾通道(KCa)、内向整流钾通道(Kir)以及背景钾通道(leak,K2P)等.这些通道有助于膜复极化，静息膜电位，发烧的频率和感觉神经元兴奋性的调节[19,20].在所有的钾通道中，电压激活钾通道在细胞去极化回复到静息状态过程中起着重要的作用，对该通道的抑制能够导致动作电位幅度的加宽[21].将膜电位钳制在-80 mV，给予脉冲宽度为500 ms，以10 mV步幅递增的去极化到+60 mV电压刺激引出DRG细胞电压门控钾电流.研究表明粗毒对DRG细胞上电压门控钾通道电流具有明显的抑制作用，100 μg/mL粗毒能够抑制44.2%±5.3%(n=5)钾电流(图2A).图2B为粗毒加入前后电压门控钾通道电流-电压关系曲线图，从图中可以看出粗毒改变了DRG细胞电压门控钾通道的起始激活电压.浓度为100 μg/mL粗毒使得钾通道的激活电压由-50±2.6 mV变为-20±1.7 mV.粗毒加入前后钾通道的半激活电压分别为21.9±2.8 mV和25.5±2.0 mV.

图2　家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞电压门控钾通道的影响(n=5)注：A表示对钾通道电流的影响，B表示其电流-电压关系曲线图

2.3粗毒对DRG细胞电压门控钙通道活性的影响

电压门控钙通道广泛存在于机体的不同类型组织细胞中，它通过调控Ca2+进入细胞来影响神经递质的释放、神经分泌、神经元兴奋和基因表达的调控等生理过程.根据它们生理学和药理学特征的不同，目前在脊椎动物中鉴定发现了5种主要的钙离子通道亚型(T、L、N、P/Q和R型)[22-24].高电压激活钙通道(L、N、P/Q和R型)需要很高的去极化电压才能够被激活，而且高电压激活钙通道与神经递质的释放密切相关.低电压激活的钙通道(T型钙通道)具有在较低的钳制电压激活、快速失活的特征.它能够调控神经元和心肌细胞起搏器的重复性活动[25].采用全细胞膜片钳技术，将膜电位钳制在-90 mV，给予脉冲宽度为150 ms，以10 mV步幅递增的去极化电压刺激引出DRG细胞电压门控钙通道电流，加入粗毒检测其对钙通道电流的影响.研究表明，家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞上电压门控钙通道具有明显的抑制作用，浓度为100 μg/mL的粗毒能够抑制大约65.4%±9.5%(n=5)钙电流(图3A).图3B为DRG细胞电压门控钙通道电流电压关系图，从图中可以看出粗毒对钙通道电流的起始激活电压、峰电压和反转电压都没有明显的影响.

图3　家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞电压门控钙通道的影响(n=5)注：A表示钙通道电流，B表示电流-电压关系曲线，C、D分别表示低、高电压激活的钙通道电流

另外，分别测定了粗毒对DRG细胞上高电压激活的钙通道和低电压激活的钙通道的影响.图3C为粗毒对低电压激活的钙通道的抑制活性图谱.将膜电位钳制在-90 mV，给予脉冲宽度为150 ms，去极化到-20 mV电压刺激引出低电压激活的钙通道电流，浓度为100 μg/mL的粗毒能够抑制大约77.7%±9.9%(n=5)低电压激活的钙电流.T型钙通道广泛分布在神经元疼痛通路中，与痛觉调制密切相关.到目前为止还未发现专一性很好的T型钙通道抑制剂.因此，如果能从家福捕鸟蛛粗毒中筛选到专一性很好T型钙通道抑制剂是具有重要意义的.家福捕鸟蛛粗毒对低电压激活的钙通道具有抑制作用表明粗毒中可能含有T型钙通道抑制剂的毒素分子.最后，发现粗毒对DRG细胞上高电压激活的钙通道也有明显的抑制作用.将膜电位钳制在-40 mV，给予脉冲宽度为150 ms，去极化到+10 mV电压刺激引出高电压激活的钙通道电流，浓度为50 μg/mL的粗毒能够抑制大约74.9%±2.8%(n=5)高电压激活的钙电流(图3D).目前，已鉴定的几种高电压激活的钙通道亚型在DRG细胞上都能够表达.N型钙通道阻滞剂能够有效的减轻因机械、化学和热刺激引起的痛觉过敏和异常性痛疼[26].P/Q型钙通道与一些特定疾病如癫痫，共济失调和偏头痛等直接有关[27].希望在家福捕鸟蛛粗毒中鉴定得到专一性很好的高电压激活钙通道的抑制剂.

3结论

蜘蛛毒素是选择性作用于昆虫和哺乳动物具有重要生理功能的活性物质的重要来源.家福捕鸟蛛粗毒是一类新型的到目前为止还未开发利用的蜘蛛毒素.课题组对这种粗毒的离子通道活性进行了初步的分析.研究发现家福捕鸟蛛粗毒中含有一些对DRG细胞上电压门控钠、钾和钙离子通道有活性的神经毒素，特别是粗毒对DRG细胞TTX-R通道和T型钙通道具有抑制活性.进一步实验需要从粗毒中筛选和鉴定这两种通道的抑制剂.现有研究为后续开展家福捕鸟蛛单一毒素分子的分离纯化、结构与功能研究提供了基础.

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Effects of Venoms from the Sqider Selenocosmia Jiafu on Voltage-gated Ion Channels in Rat Dorsal Root Ganglion Neurons

HU Zhao-tun1,2,ZHOU Xi2,XIAO Zhen2

(1.CollegeofBiologicalandFoodEngineering,HuaihuaUniversity,Huaihua,Hunan418008；2.CollegeofLifeSciences,HunanNormalUniversity,Changsha,Hunan410081)

Abstract：Selenocosmiajiafuis recently identified new species of spider in P.R.China.These medium bodied venomous spiders are distributed mainly in the hilly areas of southwest of China,mostly in Yunnan and Guangxi Province.The venom of this spider contains many components with different biological activities.In order to explore the utility of this rich source,researchers observed the effects of the venoms from the spiderSelenocosmiajiafuon voltage-gated ion Na+,K+and Ca2+channels in rat dorsal root ganglion neurons by voltage-clamp analysis.The venom could inhibit tetrodotoxin-sensitive sodium channels,tetrodotoxin-resistant sodium channels,voltage-gated potassium channel,high-voltage-activated calcium channels and low voltage-activated calcium channels in rat DRG neurons as revealed by voltage-clamp analysis.Crude venom at concentration of 100 μg/mL could inhibit 64.0%±6.2% tetrodotoxin-sensitive sodium current,46.5%±3.8% tetrodotoxin-insensitive sodium current,44.2%±5.3% voltage-gated potassium currents and 77.7%±9.9% low-voltage-activated calcium currents.At a concentration of 50 μg/mL,the venom could inhibit approximately 74.9%±2.8% of high voltage-activated calcium currents.It suggested that the venom might contain various channel antagonists,which could become candidates for valuable tools for investigation of ion channels and drug development.

Key words：Selenocosmiajiafu；spider venom；patch clamp analysis；voltage-gated ion channel；dorsal root ganglion(DRG)

收稿日期：2016-02-19

基金项目：湖南省教育厅青年基金项目(13B087)；湖南省高校产业化培育项目(10CY014)；民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室开放基金项目(HHUW2011-53,YYZW2014-1).

作者简介：胡朝暾，1977年生，男，湖南益阳人，讲师，博士，研究方向：药用植物与蜘蛛毒素.

中图分类号：Q599

文献标识码：A

文章编号：1671-9743(2016)05-0047-05