X线照射对不同放射敏感性大肠癌细胞中ATM mRNA表达的影响*

延边大学附属医院胃肠外科(延吉 133000)

于　洋　许　臻　李　革▲



X线照射对不同放射敏感性大肠癌细胞中ATM mRNA表达的影响*

延边大学附属医院胃肠外科(延吉 133000)

于洋许臻李革▲

摘要目的：探讨大肠癌细胞株HM7、HT29间辐射敏感性差异与共济失调毛细血管扩张症突变(ATM)基因的关系。方法：应用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法，分析10Gy X线照射前后HM7、HT29中ATM mRNA表达水平变化。结果：在X线照射前，HT29中ATM mRNA水平比HM7高;在照射后，HM7细胞的ATM mRNA水平在早期(1h)就出现轻度上升(是基础水平的1.4倍);而HT29细胞在照射后4h才表现为ATM mRNA量上升(是基础水平的1.6倍):两者在照射后12h左右ATM mRNA表达水平恢复接近基础水平。结论：经X线照射后，在对放射相对敏感的HT29与对放射相对抗拒的HM7细胞中，ATM mRNA水平变化规律存在差异。这种ATM mRNA表达的不同可能是导致两者放射敏感性不同的原因之一。

主题词肠肿瘤共济失调毛细血管扩张症突变蛋白/免疫学辐射效应X线衍射

研究表明，HT29对放射线的敏感性要比HM7要高[1]，究其原因还没有明确的解释。根据现有的研究报告可知，影响细胞放射敏感性主要有两方面，一是DNA损伤修复，二是细胞周期调控。大量研究表明ATM基因对DNA损伤识别、信号转导、细胞周期调控有着重要的影响[2]。ATM基因是磷酸肌醇激酶-3(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)基因家族成员。ATM蛋白分子量约为350kD，是ATM即共济失调毛细血管扩张症(Ataxiatelangiectasia，AT)的致病基因的蛋白。本实验采用RT-PCR方法，用放射线对HT29和HM7加以处理后，基于分子水平上，论证ATM基因表达与HT29、HM7的放射敏感性差别之间的联系。本实验可为大肠癌放射生物学提供实验数据。

材料与方法

1细胞株人大肠癌细胞株HT29、HM7由韩国忠南大学校医科大学分子生物学教研室提供。用含10%小牛血清(国产)DMEM培养基(Gibco公司)在37℃、5%CO2培养箱常规培养。

2研究方法

2.1RNA的提取及其质量鉴定：采用指数生长期的细胞(低温环境)，在研钵中充分研碎，用Trizol提取总RNA。RNA浓度和A260/A280值用光密度测定仪检测，并对其纯度进行鉴定。同时还要对RNA样本的完整性进行鉴定，采用紫外线检测仪观察RNA琼脂糖凝胶电泳中28s、18s、5s条带特征。

2.2 引物设计及其合成：ATM引物用PRIMER 3OUT软件，基于Gen Bank数据库中ATM基因mRNA序列提供的数据设计而成，并由上海生工生物工程公司实物。合成的引物序其上游5′ -CGGGATCCAGCTATTTGGTTTG-3′，合成的引物序其下游5′-CGGAATTCACACCTTCAACACCCGTAAT-3′。β-actin引物序列根据文献[3]设计而成。

2.3RT-PCR：在20μl逆转录体系中加入模板RNA 1μl，细胞的总RNA达0.1～1.0μg Oligo(aT)18(0.2μg/μl)4μl，用DEPC处理的双蒸水补足体积至15μl。70℃加热5min，迅速置于冰上，短暂离心。上述微量离心管内加入：10×反应缓冲液2μl，4×dNTP mix(每种10mmol)1μl，RNA酶抑制剂(40U/μl)0.5μl，M-MuLV逆转录酶(200U/μl)1μl，38℃恒温60min，进行逆转录反应。70℃加热10min，灭活逆转录酶活性。取10μl逆转录产物作PCR扩增，PCR参数：94℃45s、55℃45s、72℃ lmin，进行30次循环后(循环次数是根据其扩增动力学实验确定的)，72℃延伸6min。以GAPDH作内参照。PCR产物作2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙淀染色并分析。

2.4mRNA定量：内参照以β-actin mRNA为基准。ATMcDNA条带和β-actin cDNA条带都应该同时出现在PCR扩增产物中。借助紫外线数字成像仪，对阳性条带进行密度扫描。根据扫描结果，进一步计算出mRNA指数Ri(mRNA index)，它代表ATM mRNA在细胞中的浓度。其计算公式如下：

进行3次实验，分别测量HT29、HM7中ATM mRNA在X射线照射前后的指数，再计算其均值并比较。

2.5X线照射：被照射的细胞选定为指数生长期的细胞，用10Gy剂量的F-43型深部X线治疗机(北京东方红医疗器械厂)进行照射。照射前首先对照射剂量率进行测量，调整至96.6cGy/min，除此之外还要矫正玻璃培养瓶的衰减率。最后在12mA电流、210kV电压、0.51mmCu半价层、0.25mmCu滤过板、10cm×15cm照射视野的照射条件下进行照射。

2.6统计学方法：采用配对t检验对两组数据进行比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

1RNA质量鉴定RNA的纯度可以通过A260/A280值得出结论，所提取的RNA样本经过光密度测定仪测得A260/A280值在1.8～1.9之间，RNA纯度较好。通过紫外线检测仪，可以看到在1.2%琼脂糖凝胶电泳中28s、18s、5s三条带(图1)。从图中可以清晰的看到，18s带亮度约为28s的一半，这说明被提取的RNA未被过多降解，其完整性较好。

图1　细胞总RNA电泳

2RT-PCR结果在RT-PCR方法的结果中，出现了两条阳性条带，这说明ATM蛋白的cDNA和β-actin的cDNA存在于从HM7、HT29中提取的mRNA中。在此之后，借助UTHSCSAimage Tool分析软件计算两条阳性条带的光密度值，再进一步计算所需的Ri值(图2)。

图2　HT29、HM7中 RI值

讨论

近年来，放射线广泛应用于临床治疗大肠癌。但是，部分患者对放疗不敏感，研究大肠癌辐射敏感性有助于提高大肠癌放疗治疗效果，对临床来说有很大的意义。ATM基因突变与细胞特殊辐射敏感性的关系，使其成为研究大肠癌细胞辐射增敏的一个重要的契入点。但是目前对于这方面的研究相对较少。通过实验我们发现，ATM基因存在于大肠癌组织中，它与放疗的敏感性有着紧密的联系[3-4]。前一阶段的实验中，借助荧光免疫化学法，我们发现，ATM蛋白绿色FiTC荧光产物存在于HM7细胞核和细胞浆中，而且有60%～80%细胞的核具有较强的表达。但这种ATM蛋白水平的表达差异是否因其mRNA水平差异所致，以及HM7、HT29在受到电离辐射发生DNA损伤后，ATM mRNA 的反应如何，正是我们想进一步探讨的问题。

根据实验结果可知，未经X射线处理的两种癌细胞ATM mRNA基础含量Ri，HT29比HM7稍微低一些，经X线(10Gy)照射1 h后HT29中Ri值明显上升，约为初值的1.6倍，但HM7数值轻微下降。照射4 h后HT29值有所下降，HM7明显提升。照射12 h后HM7值显著下调，HT29值略为平稳。可见放射相对抗拒的HM7中，ATM mRNA水平在DNA受到X射线损伤后上升明显；然而，ATM mRNA水平在对放射相对敏感的HT29中却并没有太明显的变化。

研究表明，ATM基因的3′端序列与PI3K的序列具有同源性，因此DNA-PK和ATM基因都是PI3K基因家族的范畴。ATM基因在DNA损伤、修复还有细胞周期反应信号传导中都起着重要作用[5-6]。细胞由于受到放射性损害而导致双链DNA断裂，通过刺激细胞周期检测点信号转导系统，生理性ATM使受损细胞在各自的细胞周期停滞，并对其进行DNA修复；一旦ATM受损或者功能缺失，细胞的这种自我保护机制将消失，这将导致细胞周期停滞减弱，细胞发生癌变或者死亡的几率将大大增加。在细胞周期检测点信号转导通路网络中，G1/S期检测点的激活主要是借助ATM激活p53、p21等基因实现，S期和G2/M期检测点的激活主要是借助ATM激活chk1、chk2和cdc25、cdc2来实现。一旦ATM表达受到影响，将会阻碍细胞周期检测点发挥其应有的功能，细胞周期在遇到损伤时将无法阻滞，并进一步导致癌变或者死亡。由此可知，细胞放射敏感性与ATM的功能状态、表达量功能状态有着密切的联系。Guha[7]借助脑胶质瘤细胞ATM的反义RNA，通过其抑制脑胶质瘤细胞ATM蛋白的表达，实现了细胞放射敏感性的提高。再如基因治疗或激酶抑制剂等也是通过抑制ATM蛋白表达，成功实现细胞对放射线的敏感性的提高[8-9]，制造ATM基因突变状态，使ATM基因功能受到抑制[10-11]，诱发ATM基因产物表达下降[12]，都可以提高癌细胞对辐射的敏感性，这些都是提高放射治疗效果不错的方法。有研究表明[13]，ATM基因PI3K功能区的突变与细胞辐射敏感性的变化有密切的联系。同时，也有相关实验证实，细胞辐射敏感性会随着ATM/PI3K功能区的表达受抑制而发生变化[14]。

根据实验结果，我们可以得出结论，对放射相对敏感的HT29与对放射相对抗拒的HM7相比，其ATM蛋白表达水平要高。本次实验再次证明了大肠癌细胞放射敏感以及抗拒性与ATM基因表达有密切的联系，这为大肠癌放疗增加疗效提供了理论基础。

参考文献

[1]李革，李香俊，罗强，等. ATM蛋白在不同放射敏感性大肠癌细胞株中的表达[J]. 中国现代医学杂志, 2010,23:3559-3561.

[2]Lavin MF. Ataxia-telangiectasia: From arare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2008,9:759-769.

[3]李革，李林虎，尹玩熙. 凋亡相关基因与直肠癌放射敏感性相关关系的研究[J]. 陕西医学杂志，2008,37(2):131-133.

[4]李革，李林虎，尹玩熙. 直肠癌自发性细胞凋亡、ATM蛋白表达和放射敏感性关系的研究[J]. 广东医学，2008,29(3):50-52.

[5]Riches LC, Lynch AM, Gooderham NJ. Early events in the mammalian response to DNA double-strand breaks[J]. Mutagenesis, 2008,23:1409-1421.

[6]Czornak K, Chughtai S, Chrzanowska KH. Mystery of DNA repair:The role of the MRN complex and ATM kinase in DNA damage repair[J]. J Appl Genet, 2008,49:383-96.

[7]Guha C, Guha U, Tribius S,etal. Antisense ATM gene therapy: A strategy to increase the radiosensitivity of human tumors [J].Gene Ther, 2000,7:852-858.

[8]Zou J,Qiao X,Ye H,etal. Antisense inhibition of ATM gene enhances the radiosensitivity of head and neck squamous cell carcinoma in mice[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2008,27:56.

[9]Sabisz M, Skladanowski A. Modulation of cellular response toanticancer treatment by caffeine: inhibition of cell cycle cheekpoints, DNA repair and more[J]. Curr Pharm Bioteehnol, 2008,9:325-336.

[10]Cortes ML, Oehmig A, Saydam O,etal. Targeted integration of functional human ATM cDNA into genome mediated by HSV/AAV hybrid amplicon vector[J]. Mol Ther, 2008,16:81-88.

[11]Ahmed KM, Li JJ. ATM-NF-kappa B connection as a target for tumor radiosensitization[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2007,7:335-42.

[12]WILliams JR, Zhang Y, Russell J,etal. Human tumor cells segregate into radiosensitivity groups that associate with ATM and TP53 status[J]. Acta Oncol, 2007,46:628-38.

[13]Morgan SE, Lovly C, Padnita TK,etal. Fragments of ATM which have dominant-negative or complementing activity[J]. Mol Cel Biol, 1997,17:2020-2029.

[14]Guha C, Guha U, Tribius S,etal. Antisense ATM gene therapy: A strategy to increase the radiosensitivity of human tumors[J]. Gene Ther, 2000,7:852-858.

(收稿:2015-12-11)

通讯作者：▲延边大学附属医院胃肠外科

【中图分类号】R392.3

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.07.01

Effect of X-ray irradiation on the expression of mRNA ATM in colorectal cancer cells with different radiosensitivity

Surgery Department of Gastrointestinal, Yanbian University Hospital(Yanji 133000)

Yu YangXu ZhenLi Ge

ABSTRACTObjective: To investigate the relationship between ataxia-telangiectasia mutant (ATM) gene and the different radiosensitivity of two nasopharyngeal colorectal cell lines, that is HM7 and HT29. Methods: Semi-quantitive reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to measure the level of ATM mRNA in HM7 and HT29 when exposed to 10 Gy X-rays irradiation. Results: Without irradiation, the basic ATM mRNA levels in HT29 were slightly lower than in HM7. After 1 hour of irradiation, the ATM mRNA levels of HT29 increased to 1.6 times than basic levels. But the ATM mRNA levels of HM7 increased to 1.4 times than basic levels after 4 hours of irradiation respectively. At last, returned to basic levels at 12 hours after irradiation. Conclusion: After X-ray irradiation, in the cells of HT29 which is sensitive to radiation and HM7 with radiation resistance, their variation of ATM mRNA levels was different. it might be one of the reasons of different radiosensitivity.

KEY WORDSIntestinal neoplasmsAtaxia telangiectasia mutated proteins/immunologyRadiation effectsX-Ray diffraction

·论著·基础研究·

*国家自然科学基金资助项目(30960368)