两种O型口蹄疫ELISA检测试剂盒的对比

吕晓丽，姚晓韵，何奇松，冯淑萍，马 军，覃雨阳，李雪梅，熊 毅，颜健华（.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；.广西动物疫病预防控制中心，广西南宁 53000）



两种O型口蹄疫ELISA检测试剂盒的对比

吕晓丽1，姚晓韵1，何奇松2，冯淑萍2，马 军1，覃雨阳1，李雪梅1，熊 毅2，颜健华2
（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.广西动物疫病预防控制中心，广西南宁 530001）

摘 要：为比较哪种ELISA试剂盒能够更准确、简便、快捷地检测出口蹄疫病毒抗体，本研究使用液相阻断酶联免疫吸附试验（LB-ELISA）试剂盒和固相竞争酶联免疫吸附试验（SPC-ELISA）试剂盒，对2014年广西各市县动物疫病预防控制中心送检的已免疫过口蹄疫疫苗的猪、牛、羊血清共计1121份进行了检测，对比两种试剂盒的特异性、敏感性、阳性检出率及符合率。检测结果表明，两种口蹄疫ELISA试剂盒的阳性检出率不同，LB-ELISA的阳性检出率比SPC-ELISA高2.4%；LB-ELISA试剂盒对血清抗体滴度水平的要求相比SPC-ELISA试剂盒要低，因此LB-ELISA试剂盒更适合于口蹄疫病毒感染的检测。

关键词：O型口蹄疫；抗体；液相阻断酶联免疫吸附试验；固相竞争酶联免疫吸附试验；比较

口蹄疫（FMD）由口蹄疫病毒（FMDV）引起，主要感染牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物［1］。口蹄疫病毒具有高突变率和重组性，因此它的血清型众多且易变异，而多种血清型之间不存在交叉免疫；各血清型中还有不同亚型，其抗原性也存在一定程度上的差别［2］。另一方面，口蹄疫传播迅速，这给口蹄疫的诊断、控制和根除带来了困难。目前在我国，疫苗免疫是最主要手段。酶联免疫吸附试验因在口蹄疫检测中具有敏感、特异、稳定、安全、快速、简单易于操作等特点而备受青睐。本研究利用两种O型口蹄疫ELISA检测试剂盒对血清进行检测，以期选择更简便、更准确的方法用于大规模检测，以便做好口蹄疫防治工作，也有利于试剂盒的不断改进。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清。广西南宁、玉林、钦州、防城港、崇左、北海、百色等地各级动物疫病预防控制中心送检的猪、牛、羊血清共1 121份，由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室保存。详情见表1。

表1 血清样品来源

1.1.2 试剂盒。液相阻断酶联免疫吸附（LB-ELISA）试剂盒，购自兰州兽医研究所；固相竞争酶联免疫吸附（SPC-ELISA）试剂盒，购自北京金诺百特科技有限公司。

1.1.3 实验仪器与设备。96孔V形血凝板、移液器、酶标仪、振荡器、37 ℃恒温培养箱。

1.2 方法

1.2.1 液相阻断酶联免疫吸附试验（LB-ELISA）。实验方法主要参考说明书，并做部分修改，具体步骤如下：在96孔V形血凝板上，如表2所示，依次用1×PBST稀释样本血清（猪血清递次稀释至第5孔，牛、羊血清稀释至第6孔），按50 μL/孔加病毒抗原，4孔病毒抗原对照孔仅加入100 μL病毒抗原，振荡30 s，封板，4 ℃过夜；将稀释液按表3所示的次序50 μL/孔转移至包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上后按说明书步骤继续操作。

表2 96孔V形血凝板稀释样品布局

表3 96孔酶标板检测样品布局

1.2.2 固相竞争酶联免疫吸附试验（SPC-ELISA）。按说明书进行检测。

2 结果

2.1 LB-ELISA试验结果

表4 液相检测结果

2.2 与LB-ELISA相比较的SPC-ELISA试验结果

表5 固相检测结果

2.3 两种不同ELISA对所有送检血清的阳性率检测结果

表6 两种ELISA对所有血清检测结果

3 分析讨论

通过液相阻断ELISA和固相竞争ELISA两种不同口蹄疫抗体检测方法对所有血清检测得到的结果可知，两种方法的抗体阳性检出率差别不大。但总体上说，液相竞争ELISA的阳性检出率稍高，多数差别在5%左右。但也有例外，如编号为7的防城港送检的100份猪血清，SPC-ELISA的阳性检出率比LPB-ELISA阳性检出率高出20%左右。出现这种特殊情况的原因有很多，其中血清质量不好是主要因素，具体影响因素有待进一步研究。

在本研究运用的两种方法中，液相阻断酶联免疫吸附试验所得阳性率比固相竞争酶联免疫吸附试验高，因此将液相阻断酶联免疫吸附试验所得实验结果作为标准计算固相竞争酶联免疫吸附试验敏感性、特异性及符合率。本实验所用固相竞争酶联免疫吸附试验试剂盒检测猪血清的敏感性较高，为90.18%，牛羊血清稍低，为86%左右；特异性普遍较低，在羊血清中表现稍高，为81.58%。因此若将液相阻断酶联免疫吸附试验作为标准，那么固相竞争酶联免疫吸附试验试剂盒正确判断阳性率比正确判断阴性率高。两种方法检测结果都为阳性的样品中，猪血清阳性率为58.06%，与液相检测结果相差较小，为1.54%；牛羊血清相差较大，为10%左右。

实验中存在用两种不同ELISA检测方法测得数据存在较大差距的血清。如编号为“防2014352”南宁隆安送检的羊血清（30份）用不同方法检测，数据相差18%；编号为“防2014165”来自防城港送检的猪血清（100份）用两种不同检测方法检测的数据相差20%；编号为“防2014285”某养殖场送检的猪血清（25份）用两种不同检测方法得到的数据相差28%。造成两种试剂盒检测结果差异大的原因可能为：从外观上看，两种不同检测方法检测结果差别较大的血清部分出现溶血或者浑浊的现象，而其余没有溶血或者浑浊现象的血清检测结果差别较小，仅5%左右。ELISA血清学试验对血清质量的要求相对严格，溶血或混浊严重、被细菌污染都可以产生非特异性显色，导致检测结果受其干扰。待检血清保存不当也可能导致检测结果异常。在冰箱中保存过久，血清就会聚合成多肽体，酶标板清洗不彻底，这些因素都会导致在检测时出现假阳性。由于两种试剂盒的检测实验不是同时进行，所以待检血清多次被冻融也会造成检测结果差异大。

本实验所用血清是广西各地方动物疫病预防控制中心送检的免疫过口蹄疫疫苗的的动物血清。因各地所用疫苗不尽相同，所以不同疫苗对实验结果有着一定影响。有实验研究证明合成肽疫苗的免疫效果普遍比较好，第一次免疫后很快就可以检测到免疫抗体，并且免疫合格率能达到90%以上，第二次免疫后能全部达到100%［3］。但使用常规的O型口蹄疫灭活疫苗后，用本实验所用的两种EILSA试剂盒检测，第二次免疫后所产生的免疫抗体仍比较低，最高的也只有60%。

通过对多组血清的检测结果进行比较，发现有多份血清的SPC-ELISA检测结果呈阴性，即抗体水平在临界值的边缘，但LPB-ELISA结果却呈阳性。这说明LPB-ELISA对血清抗体水平的要求比SPC-ELISA要低，因此更加适用于口蹄疫的快速检测。

参考文献：

［1］郎洪武，杨汉春.口蹄疫研究进展［J］.中国兽药杂志，2005，39（10）：16-21.

［2］Domingo E，Escarmis C，Baranowski E，et al.Evolution of foot-and-mouth disease virus［J］.Virus Res，2003，91（1）：47-63.

［3］秦荣香，曹玉美，陆江，等.不同口蹄疫疫苗免疫效果及检测方法评估［J］.养猪，2010（2）：62-63.

（责任编辑：朱迪国）

Comparison of Two ELISA Kits for Detection of Type O FMDV Antibody

Lü Xiaoli1，Yao Xiaoyun1，He Qisong2，Feng Shuping2，Ma Jun1，Qin Yuyang1，Li Xuemei1，Xiong Yi2，Yan Jianhua2
（1.College of Animal Sciences and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530005；2.Guangxi Animal Disease Prevention and Control Center，Nanning，Guangxi 530001）

Abstract：Aimed to compare which of the ELISA kits could detect antibodies against foot-and-mouth disease virus more easily，accurately and quickly，1 121 serums of swine，bovine and sheep immunized foot-and-mouth disease vaccine provided by animal disease prevention and control center of various cities in Guangxi province were tested by LB-ELISA kits and SPC-ELISA kits.The sensitivity，specifi city，antibody positive ratio and coincidence rate between the LB-ELISA kits and SPC-ELISA kits were compared.The results showed that the positive rates of two kinds of ELISA kits were different.The positive rate of LB-ELISA was 2.4% higher than that of SPC-ELISA.The requirment of antibody level of LB-ELISA kit was lower than that of SPC-ELISA kit.So the LB-ELISA kits were more suitable for detecting the footand-mouth disease virus infection.

Key words：serotype O FMDV；antibody；LB-ELISA；SPC-ELISA；comparison

中图分类号：S852.5

文献标识码：A

文章编号：1005-944X（2016）03-0071-03

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.03.024

基金项目：广西科技厅科技攻关项目（桂科攻0779001）

通讯作者：颜健华