汉坦病毒荧光抗体中和试验方法的建立

李琦　魏亚梅　韩旭　韩占英　张艳波　许永刚　齐顺祥



·技术方法·

汉坦病毒荧光抗体中和试验方法的建立

李琦魏亚梅韩旭韩占英张艳波许永刚齐顺祥

050021 石家庄，河北省疾病预防控制中心

【摘要】目的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)技术应用于汉坦病毒中和抗体的检测的探索与改进。方法采用固定病毒稀释血清的方法，将不同稀释度的血清和固定浓度的病毒经37 ℃中和1 h，然后加入到Vero-E6细胞已长成单层的96孔板上，37 ℃、5% CO2培养7 d，经固定和荧光染色, 即可在荧光显微镜下判定结果，根据公式计算血清的中和滴度。结果最合适的细胞浓度为4×104～4.5×104/孔，病毒血清混合液在37 ℃中和较好。用此方法检测双价灭活疫苗免疫后30份人血清标本的中和抗体，与空斑减少中和试验结果比较，该方法较敏感、稳定。结论荧光抗体病毒中和试验法具有快速、简便、敏感、稳定的特点。

【主题词】肾综合征出血热；汉坦病毒；荧光抗体病毒中和试验

Fund programs: Hebei Province Science and Technology and Development Plan Program (13277719D)

汉坦病毒(Hantaviruses, HV)是肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndromes，HFRS)的主要病原体，主要临床表现为发热、出血和肾脏损害，病死率高，危害严重。目前，HV中和抗体的检测方法主要是细胞微量中和试验和空斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Tests，PRNT)。PRNT具有实验周期长、技术难度大、实验条件要求高等缺点，一般难以开展。细胞微量中和试验操作相对简便，更适用于国内应用和推广[1]。作为狂犬病病毒中和抗体水平测定的最佳方法之一的荧光抗体病毒中和试验(Fluorescent Antibody Virus Neutralization，FAVN) 技术，具有结果判定受主观因素影响小、可靠性高、操作简单、检测结果一致性好，适合大规模样本检测等优点，此方法在HV中和抗体检测中较少报道。因此，我们参考检测狂犬病病毒血清中和抗体的方法[2-3]，建立起了HV荧光抗体中和试验技术，用于HV中和抗体检测，现介绍如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病毒来源:本实验室保存的分离自HFRS病人血清的HV毒株(SEOV，Ⅱ型)。

1.1.2Vero-E6细胞:中国疾病预防控制中心病毒病所惠赠，按常规方法传代。

1.1.3血清标本:本室保存于-80 ℃冰箱的经双价HFRS沙鼠肾灭活疫苗免疫后的第28天采集血清标本[4]。

1.1.4抗体的荧光标记:研究中所用HV单克隆抗体滴度为1∶10，由解放军第四军医大学生产。荧光标记的具体操作参照文献[5]进行。

1.2荧光抗体病毒中和试验

1.2.1病毒TCID50的测定: 将HV病毒在96孔板中进行10倍系列稀释, 每个稀释度4孔，每孔0.1 ml，37 ℃温育1 h，然后加入到Vero-E6细胞已长成单层的96孔板中，37 ℃、5% CO2培养7 d。弃去液体，80%的冷丙酮固定15 min，加入荧光标记的抗体滴度为1:10的HFRS单克隆抗体37 ℃温育30 min，冷风吹干，荧光显微镜下观察结果。凡有不少于1个荧光颗粒的孔，即记为阳性，否则记为阴性。细胞半数感染量(TCID50)的计算参考Karber公式推导得出[6]，IgTCID50=L-d(s-0.5)，其中L=最高稀释度的对数；d=稀释对数之间的差；s=阳性孔比率总和。

1.2.2荧光抗体病毒中和试验:采用固定病毒稀释血清的方法进行[2，7]。对照血清和待检血清56 ℃ 30 min预先灭活，然后在96孔板上进行2倍系列稀释(允许检测前以一定比例稀释)，每稀释度4孔，每孔50 μl，与100TCID500.1 ml的病毒液50 μl等量混合，37 ℃中和1 h，将血清病毒混合液加入到Vero-E6细胞已长成单层的96孔板上，37 ℃、5% CO2培养7 d，80%的冷丙酮固定15 min，0.1%的伊文斯兰染色，应用间接免疫荧光法在荧光显微镜下观察结果。凡有至1个荧光颗粒的孔，即记为阳性，否则记为阴性。中和滴度的计算公式参考Karber公式推导得出：即对照血清的半数中和稀释倍数N50c=1.414Xc×2Yc/4，待测血清半数中和稀释倍数为N50t=1.414Xt×2Yt/4。X(表示完全中和，即最大稀释倍数的4个重复孔全部无荧光颗粒)，Y(表示完全中和后无荧光颗粒的孔数)。Z=10×N50t/N50c，即为待测血清的HV中和滴度。对照血清的中和抗体滴度为10，利用Microsoft Excel软件按前述公式设定的X、Y变量计算中和滴度的最终值Z。

1.3空斑减少中和试验参照文献进行[1]，简述如下：在24孔培养板中将Vero-E6细胞按每孔细胞数4.0×103进行培养2 d，待细胞长成单层后加入在冰浴中以细胞维持液10倍系列稀释的待测HV病毒液，每孔0.1 ml，每稀释度2孔，37 ℃吸附1.5 h后直接加入含0.6%琼脂糖的细胞生长液，每孔1.5 ml，37 ℃、5% CO2培养，先正置30 min待琼脂糖凝固后再倒置培养，7 d后加入第二层覆盖物(含0.01%中性红的0.6%琼脂糖的细胞生长液)，空斑于2 d左右产生并观察计数。

2结果

2.1细胞密度对观察结果的影响将细胞密度不同的单层细胞接种病毒培养7 d后发现，长成单层的Vero-E6细胞最合适密度为4×104～4.5×104/孔，这种密度的细胞接种病毒培养7 d后易产生清晰有特异性荧光颗粒的荧光灶(见表1)。

表1　细胞密度对观察结果的影响

2.2温度对试验结果的影响血清病毒混合液分别经37 ℃中和1 h和4 ℃中和过夜，然后接种细胞37 ℃、5% CO2培养7 d，观察形成的荧光灶。结果发现，经37 ℃中和1 h的混合液最终产生的荧光灶较少，而4 ℃中和后产生的荧光灶较多。说明血清病毒混合液的中和作用选择在37 ℃中和较好。

2.3FAVN法和PRNT法敏感度比较FAVN法和PRNT法敏感度比较 分别利用FAVN法和PRNT法对HFRS双价灭活疫苗免疫后人血清标本30份进行中和抗体检测。检测结果中和抗体滴度≥10的标本判为阳性。如表2所示，两种方法检测中和抗体滴度均≥10的标本18份，均<10的5份，FAVN法检测≥10而PRNT法检测<10的有7份。经配对四格表χ2检验，χ2=5.143，P<0.05，可以认为两种方法的检测结果不同，FAVN法的阳性检测率较高。为消除病毒量的不同对PRNT测定结果的影响，两种方法均采用100TCID500.1 ml病毒量进行试验。在操作过程中两种方法均分别设立了阳性对照和空白对照。表3所示，同一标本用FAVN法测定的中和抗体阳性滴度高于PRNT法测得的滴度，经相关性检验，r=0.692，表明两种方法成正相关，可以认为FAVN法的敏感度高于PRNT法。

表2　FAVN与PRNT两种方法对血清HV中和抗体滴度的检测结果

2.4FAVN法的重复性将FAVN法和PRNT法检测均阳性的18份血清标本进行3次FAVN法检测，结果如表3所示。经方差分析F=0.097，P>0.05，3次的检测结果差异没有统计学意义，表明FAVN法具有较好的重复性。

3讨论

中和抗体的型特异性最强，是估价是否具有免疫保护力最重要的指标之一[8]。PRNT是血清学检验的金标准, 是最早应用的经典的HV分型方法。但该方法的要求高、操作难度大，所需时间长大大限制了它的应用。FAVN法用于检测狂犬病毒血清标本的中和抗体已在国外广泛应用[9-10]，但用于血清标本HV中和抗体的检测在国内外较少报道。本研究通过摸索和改进将FAVN法应用于HV中和抗体的检测。本研究中FAVN法检测约需7～8 d，而PRNT法约需2周，缩短了试验周期；FAVN法利用的是抗原抗体特异性荧光染色在显微镜下直接观查结果，中和抗体滴度的得出依据公式进行，操作简便；而PRNT法对操作手法要求较高，判定结果时易受主观因素影响，要求观察者具有很好的经验因而误差偏大。

研究发现FAVN法和PRNT法均对细胞密度有一定要求，细胞密度适当才能观察到清晰明显的特异性荧光颗粒和形状规则、计数准确的噬斑。FAVN法在37 ℃中和1 h和4 ℃中和过夜产生的中和抗体滴度没有显著性差异，但血清病毒混合液在37 ℃中和1 h测得的荧光颗粒较易观察且用时较短，故本研究将37 ℃中和1 h作为中和的条件。FAVN能够准确计算中和抗体的滴度，属于定量实验，对毒株的要求较高，应每隔一段时间对毒株的TCID50重新测定，保证结果的准确可靠。

表3　FAVN法和PRNT法检测免疫后人血清HV中和抗体滴度比较

本研究建立的HV荧光抗体中和试验技术，不仅适用于常规样本的检测，同时适用于疫苗免疫后样本的检测，为HFRS疫苗的评价提供有力的技术手段。

4参考文献

[1]白雪帆,杨为松,张文彬,等.细胞微量中和试验和空斑减少中和试验在HFRSV中和抗体测定中的比较[J]. 现代检验医学杂志,1993,8(3):155-156.

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[5]沈关心,周汝麟.主编.现代免疫学实验技术[M].武汉：湖北科学技术出版社，1998，96-98,162-165.

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[10]Shiraishi R, Nishimura M, Nakashima R, et al. Determination of critical factors causing cytotoxicity in the virus neutralization test. J Virol Methods, 2014，4(199):46-52. doi:10.1016/j.jviromet.2014.01.006.

通信作者：李琦，Email：liqinew@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.017

基金项目：河北省科技研究与发展计划项目(13277719D)

(收稿日期：2016-04-08)

Establishment and application of fluorescent antibody virus neutralization test for Hantavirus

LiQi,WeiYamei,HanXu,HanZhanying,ZhangYanbo,XuYonggang,QiShunxiang

HebeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Shijiazhuang050021,ChinaCorrespondingauthor:LiQi,Email：liqinew@126.com

【Abstract】ObjectiveTo establish a fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) test for hantavirus (HV). MethodsWith the method of dilution serum and fixed virus, the serum samples were diluted with different concentration, and with virus-liquid were mixed in 96 culture plate hole, 37 ℃ for 1 hour. Then the mixture of serum and virus was added to Vero-E6 cells which had grown into a monolayer, and cultivated in the 37 ℃, 5% CO2 incubator for 7 days; the 96-well plate was fixed and stained. The results were observed under a fluorescence microscope. The neutralization titer was calculated according to the formula. ResultsThe suitable cell concentrations is 4×104～4.5×104/hole, and the proper temperature for neutralize is 37 ℃. 30 serum specimens of HFRS were tested by FAVN and PRNT, the FAVN is more sensitive and stable. ConclusionFAVN is easier, faster and more sensitive than the others.

【Key words】Hemorrhagic fever with renal syndromes; Hantavirus; Fluorescent antibody virus neutralization