青梗菜游离小孢子培养技术研究

方 辉，胡锦彬，薄永明

（宁波微萌种业有限公司，浙江 宁波 31500）

青梗菜游离小孢子培养技术研究

方 辉，胡锦彬，薄永明*

（宁波微萌种业有限公司，浙江 宁波 31500）

以15份不同基因型的青梗菜杂交种为试材进行游离小孢子培养，探讨花蕾长度和供体植株基因型对青梗菜小孢子培养的影响。结果表明，青梗菜小孢子培养的适宜花蕾长度为2.0～3.0 mm，基因型是影响青梗菜小孢子培养的关键因素。共获得138株小孢子植株，经流式细胞仪鉴定，其中64.7%为二倍体植株，基本建立了利用游离小孢子培养技术创制青梗菜D H系的技术体系。

青梗菜；小孢子培养；基因型

文献著录格式：方辉，胡锦彬，薄永明.青梗菜游离小孢子培养技术研究［J］.浙江农业科学，2016，57（1）：76-79.

青梗菜是小白菜（Brassica raPa L.ssp. chinensis L.Kitamur）中一类束腰、叶色亮绿、品质优良的品种，属异花授粉作物，杂种优势明显。近年来，随着游离小孢子培养技术的不断发展，利用该技术辅助传统育种可提高育种效率，缩短育种周期［1］，已有研究在小白菜游离小孢子培养技术上取得较大进展［2-5］。但游离小孢子培养的胚胎发生频率及基因型的反应范围存在很大差异，限制了该技术在遗传育种和基础研究上的进一步应用。本研究以15份不同基因型的青梗菜为试材进行游离小孢子培养，对培养过程中影响胚状体产生频率的几个关键因素进行探讨，为进一步完善青梗菜小孢子培养技术体系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为15份不同基因型的青梗菜杂种1 代（表1），均为市场主流品种，由宁波微萌种业有限公司引进。2014年9月播种，10月定植于大田，常规管理并调查其农艺性状。12月底，每个品种各选10棵健壮植株移栽于单栋大棚越冬。2月底至4月中旬取适宜花蕾进行游离小孢子培养。

表1 供试青梗菜材料的名称及来源

1.2 游离小孢子的分离和培养

供试植株抽薹开花后，于晴天上午8：00—9：00取材，选择适宜花蕾用于游离小孢子培养。用75%酒精消毒花蕾30 s，再用2%N a C 1 O振荡消毒15 min，灭菌水清洗3次，每次1 min。将无菌花蕾置于50mL离心管，加5mL洗涤培养基（13% B 5液体），用玻璃棒轻捣释放小孢子。悬浮液经孔径40 μ m的细胞过滤器过滤，收集滤液于50mL离心管中，800 r·min-1离心5 min；弃上清，沉淀物用5mL洗涤培养基重悬，800 r·min-1离心3 min；弃上清，纯化后小孢子加入胚状体诱导培养基（13%N L N液体），用血球计数板在显微镜下镜检，并调节小孢子密度至1万个·m L-1，每皿5mL分装到直径6 cm的无菌培养皿中，封口膜封口。

将分装好的小孢子悬浮液置于恒温培养箱中进行32℃热激诱导1 d后，转入25℃恒温培养箱中继续暗培养，直至肉眼可见胚状体出现。出胚培养皿移至恒温摇床，50 r·min-1，25℃暗培养。游离小孢子培养25 d后统计出胚数目。待胚状体长至3 mm大小时转入胚状体再生培养基（3%MS固体，2mg·L-16-B A，0.1mg·L-1I A A），再生苗诱导培养条件为温度25℃，昼夜光周期16 h/8 h，光照强度1 500 1 x。期间将形成的芽转入生根培养基（3%MS固体，0.1mg·L-1I A A）中培养。将室外炼苗2 d的再生苗洗去培养基后移植到32穴穴盘，2周后定植于大棚，成活后取植株幼嫩叶片，利用流式细胞仪（B D A c c ur iC 6）检测其倍性。

1.3 适宜小孢子培养的花蕾长度

以G P-1，G P-13，G P-15为试材，在生长健康的植株花序上选取不同长度的花蕾进行D P A I染色。选取2～3个花蕾置于1.5mL离心管中，加入100 μ L水，用塑料棒轻捣释放小孢子，取上清滴加1～2滴DAPI染液，室温暗处理染色15 min后制片，用荧光显微镜观察、照相，并记录处于单核靠边期至双核早期的小孢子外部形态。培养中的小孢子于倒置显微镜下进行形态学观察。

2 结果与分析

2.1 小孢子不同发育时期的DAPI染色观察

青梗菜小孢子发育过程可分为四分体时期、单核期、双核期、三核期。经DAPI染色观察，单核靠边期的青梗菜小孢子细胞核位于细胞边缘，靠近细胞壁，细胞近圆形，可看到3条萌发沟。双核早期小孢子经第1次有丝分裂在细胞内形成1个营养核和1个生殖核。此时细胞的外部形态为圆形，萌发沟变浅。由DAPI染色结果可知，随着小孢子不断生长发育，其细胞体积不断增大，由最先的三棱形细胞转变为圆形细胞，最后变成椭圆形成熟小孢子。处于单核靠边期至双核早期的小孢子可观察到萌发沟，细胞近圆形或椭圆形，可作为单核靠边期至双核早期的细胞形态指标。

2.2 小孢子处于单核靠边期至双核早期所对应的花蕾长度

对于青梗菜，适于培养的小孢子发育时期一般是单核靠边期至双核早期。而花蕾长度与小孢子的发育时期有明显的对应关系。本研究将采集的G P-1，G P-13和G P-15花蕾混合，按照长度分类，可分为3个等级：（1）2.0～3.0 mm，（2）3.0～3.5 mm，（3）3.5～4.0 mm。镜检和DAPI染色观察，依据单核靠边期至双核早期的小孢子细胞学特征，找出大部分小孢子处于该时期所对应的花蕾长度，即为适宜游离小孢子培养的花蕾长度。从DAPI染色结果可知，不同基因型青梗菜材料单核靠边期所对应的花蕾长度均在2.0～3.0 mm。在实际应用中，可依据试验结果，直接选取长度为2.0～3.0 mm的花蕾用于游离小孢子培养。

2.3 青梗菜小孢子培养过程中的细胞学观

在小孢子培养过程中，用倒置显微镜观察小孢子培养过程中各个发育时期的形态。经24 h热激处理后，部分小孢子明显膨大成圆球形，直径为原细胞的2～3倍（图1中a）；3 d后，膨大的小孢子发生第1次分裂，除个别为不均等分裂外（图1 中b），其余大部分为均等分裂（图1中c）；7 d后可观察到分裂多次的细胞团（图1中d）；10～11 d后可观察到球形胚和心形胚（图1中 e，f）；第12～15天时可观察到鱼雷形胚和子叶形胚（图1中g，h）。此外还发现不同基因型青梗菜的小孢子胚胎发生均具有不同步性，在同一个皿中可以观察到不同形态胚状体并存的现象（图1中 i），因此在实际操作过程中，同一个培养皿中的胚状体需要根据胚状体发育情况分批次进行转胚。

图1 青梗菜小孢子离体发育过程

2.4 供体植株基因型对青梗菜小孢子胚发生能力的影响

由表2可见，供试的15份青梗菜中有10份诱导出胚，其中G P-2，G P-4，G P-15出胚率相对较高，达1.04，0.87和0.89胚·蕾-1，其余7份出胚材料的出胚率较低，在0.5胚·蕾-1上下。由此可见，不同基因型的青梗菜小孢子胚胎发生能力有很大差异，在相同培养条件下，基因型是影响青梗菜小孢子培养成功与否的重要因素。

表2 不同基因型青梗菜诱导形成胚状体结果

2.5 青梗菜小孢子胚状体的继代培养

将培养25 d后的胚状体转接到胚状体再生培养基上继续培养，待胚状体萌发分化后，将再生芽转接到生根培养基，培养中发现，大部分的子叶形胚均能正常发育、分化，最后形成健全植株（图2），而球形、心形和鱼雷形胚状体分化困难甚至褐化死亡。这表明幼期胚状体不易诱导成苗，子叶形胚易进行继代培养，还需要进一步探索继代培养中各条件对胚状体发育及分化的影响，以优化青梗菜胚状体继代培养条件，进而提高青梗菜游离小孢子培养效率。

2.6 再生植株倍性检测

通过流式细胞仪对获得的再生植株进行倍性测定，以正常二倍体青梗菜植株为对照。测定的138份材料中，单倍体材料占17.6%，四倍体材料占11.8，嵌合体占5.9%，二倍体材料占64.7%，这说明青梗菜小孢子培养过程中发生了自然加倍现象，且加倍频率较高，另外本研究中嵌合体的出现频率相对较高，这可能与部分材料多次继代培养有一定的关系。

图2 青梗菜小孢子胚状体的萌发与植株再生

3 小结与讨论

在游离小孢子培养中，小孢子发育时期与胚诱导成功率密切相关，因此选择合适发育时期的小孢子尤为重要。前期研究表明，青梗菜小孢子适宜取材时期为单核靠边期至双核早期。本研究采用D P A I染色方法，确定了单核靠边期至双核早期的细胞形态；对不同长度花蕾小孢子进行显微观察，明确了处于单核靠边期至双核早期的小孢子所对应的花蕾长度。3条萌发沟是该时期小孢子最为明显的细胞形态学特征，可作为此发育时期的形态学标志。本研究表明，青梗菜用于小孢子培养的适宜花蕾长度一般为2.0～3.0 mm，但在实际应用中，受供体植株生长环境及植株状态影响，还需根据情况确定适宜长度的花蕾进行游离小孢子培养。

目前，小孢子培养技术在不同作物育种中已经广泛应用。在探讨大白菜［6］、甘蓝［7］、花椰菜［8］、萝卜［9］等小孢子培养因素的研究中，基因型是决定游离小孢子培养成功与否的关键因素。在本研究中，基因型仍是影响青梗菜小孢子培养的重要因素，且不同基因型青梗菜的小孢子胚发生能力有很大差异，能否通过优化培养条件来克服基因型对青梗菜小孢子培养的限制，还需进一步的试验验证。本研究对再生植株的倍性进行鉴定，发现自然加倍率达到64.7%，其余为单倍体、嵌合体及四倍体材料，这与C he n等［10］研究结果大体一致。自然加倍省去了复杂繁琐的人工加倍，为纯合二倍体植株的创制与利用提供了便利，但如何利用同时获得的单倍体及四倍体材料，还需进一步试验探究。

［1］杨丽梅，方智远，刘玉梅，等.利用小孢子培养选育甘蓝自交系［J］.中国蔬菜，2003（6）：31-32.

［2］曹鸣庆，李岩，蒋涛，等.大白菜和小白菜游离小孢子培养试验简报［J］.华北农学报，1992，7（2）：119-120.

［3］李岩，刘凡，曹鸣庆.通过游离小孢子培养方法获得小白菜三个变种的胚胎及植株［J］.华北农学报，1993，8（3）：92-97.

［4］蒋武生，原玉香，张晓伟，等.小白菜游离小孢子培养及其再生植株［J］.河南农业大学学报，2005，39（4）：398-401.

［5］冯辉，杨硕，王超楠，等.青梗菜优异 D H系的创制与利用［J］.中国农业科学，2009，42（9）：3195-3202.

［6］赵俊，巫东堂，赵军良，等.影响大白菜游离小孢子培养若干因素的研究［J］.山西农业科学，2008，36（8）：26-28.

［7］梁娟，俞金龙，巫水钦，等.甘蓝D H系构建技术体系的建立［J］.浙江农业科学，2015，56（5）：669-674.

［8］张晓芬，王晓武，张延国，等.花椰菜游离小孢子培养再生植株研究［J］.中国蔬菜，2005（1）：16-17.

［9］张丽.萝卜游离小孢子培养技术初探［J］.园艺学报，2004，34（5）：676-678.

［10］CHEN Z Z，SNYDER S，FAN Z G，et a1.Efficient production of doub1ed hap1oid p1ants through chromosome doub1ing of iso1ated microspores in Brassica naPus［J］.P1antBreeding，2006，113（3）：217-221.

（责任编辑：张瑞麟）

S634

A

0528-9017（2016）01-0076-03

10.16178/j.issn.0528-9017.20160129

2015-11-05

宁波市农业科技攻关项目（2014C 10007）

方 辉（1988-），男，浙江宁波人，硕士，从事蔬菜育种工作，E-mai1：fangwurs@126.com。

薄永明，E-mai1：boyongming2@vip.sina.com。