蜂蜜中泰乐菌素A的稳定性研究

陈惠兰　张晓燕　陈磊　殷耀　丁涛　朱文君　黄娟　杨雯筌（江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心国家蜂产品基准实验室，南京210001）

蜂蜜中泰乐菌素A的稳定性研究

陈惠兰张晓燕陈磊殷耀丁涛朱文君黄娟杨雯筌
（江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心国家蜂产品基准实验室，南京210001）

泰乐菌素A对控制有土霉素抗性的美洲幼虫腐臭病很有效，且对蜜蜂的生长毒性较小，但过度使用会在蜂产品中残留。由于蜂蜜为弱酸性，泰乐菌素A在酸性条件下易降解。本文研究了不同温度下蜂蜜中泰乐菌素A的稳定性，并建立了蜂蜜中泰乐菌素A及其降解产物脱红霉糖泰乐菌素的测定方法：以pH 6.0的磷酸盐缓冲液为提取剂，经HLB小柱净化富集后，采用高效液相色谱串联质谱法测定。该方法前处理简单，对泰乐菌素A和脱红霉糖泰乐菌素的检出限和定量限分别为1.0和2.0μg/kg，回收率范围为70.75～89.28%，RSD为6.4～8.9%。方法回收率稳定且重现性较好，能满足日常检测工作的需要。

蜂蜜；泰乐菌素A；脱红霉糖泰乐菌素；稳定性；高效液相色谱串联质谱

引言

泰乐菌素A是从弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的培养液中获得的一种大环内酯类抗生素，早在1970年泰乐菌素首次被报道可作为治疗美洲幼虫腐臭病（AFB）的候选药物，2002年Elzen P等发现其对控制有土霉素抗性的AFB很有效，且对蜜蜂的生长毒性较小[1]，所以美国FDA批准其用于蜜蜂AFB的治疗。然而抗生素过度使用不但会在蜂产品中残留、影响蜂产品的品质，还能破坏蜂群内微生物平衡，给有害菌发展创造条件并诱导其产生耐药性，甚至会造成环境的污染。

目前的文献多是关于蜂蜜中泰乐菌素残留的检测方法，涉及其在蜂蜜中稳定性的研究比较少，由于大环内酯类抗生素在酸性条件下不稳定，而蜂蜜呈弱酸性，所以研究蜂蜜中泰乐菌素A的稳定性及其降解产物有助于确定养蜂过程中的休药期，避免蜂蜜产品中抗生素残留超标。

泰乐菌素的检测方法主要有ELISA法[2]、生物传感器法[3-4]、胶体金法[5]、高效液相色谱法[6-8]以及高效液相色谱串联质谱法[9-10]，由于ELISA法、表面等离子共振生物传感器法、胶体金法、高效液相色谱法等存在灵敏度低、假阳性等情况，高效液相色谱串联质谱法是最常用的检测方法。本文主要采用高效液相色谱串联质谱法比较了不同温度下蜂蜜中泰乐菌素A的降解情况，同时检测降解产物脱红霉糖泰乐菌素的含量。

1　材料与方法

1.1仪器与材料

Thermo Finnigan Surveyor液相色谱系统和 TSQ Vantage串联四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源（Electron Spray Ionization，ESI）；N-EVAPTM111氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；超纯水器（MILLIPORE公司）。

1.2试剂与溶液

泰乐菌素A（USP）、脱红霉糖泰乐菌素标准品（Toronto Research Chemicals Inc.）。用甲醇溶解并配成0.5 g/L的标准储备液，再逐级稀释成0.5 mg/L的混合标准工作液。标准工作曲线按照1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L的浓度配成6点标准溶液。磷酸氢二钾、盐酸均为分析纯，甲醇、甲酸均为色谱纯。0.2mol/L磷酸二氢钾缓冲液：称取 22.8 g K2HPO4·3H2O，用300mL水溶解，用盐酸溶液调节pH至6.0，用水定容至500mL。

1.3样品前处理

1.3.1样品提取和净化

称取蜂蜜样品5.00（±0.05）g于50 ml具塞聚丙烯离心管中，加入磷酸盐缓冲液15 ml，涡旋混匀1min，上清液过滤于一干净玻璃离心管中，过HLB小柱（预先用3 ml甲醇和3 ml水处理）净化。上样后用3 ml水淋洗，用5 ml甲醇洗脱。洗脱液于45℃水浴氮气吹干，残渣用1.0 ml甲醇-水（3∶7）溶解，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.3.2分析测定条件

HPLC条件：Varian Polaris C-18色谱柱（100mm× 2.1 mm,5 μm）；流动相：A，甲醇，B，0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～1 min 10%A，1.1～2 min 10～60%A，2.1～7min 60%A，7.1～8min 60～90%A，8.1～9min 90%A，9.1～11min 10%A；流速：0.25 ml/min；柱温为室温，进样体积为25 μl。

MS/MS条件：采用ESI源，正离子方式检测；喷射电压：2500 V；鞘气（Sheath Gas）50，辅助气（Auxiliary Gas）6。其他质谱条件见表1。

表1　泰乐菌素A和脱红霉糖泰乐菌素的母离子、子离子和碰撞能量

3　结果与讨论

3.1前处理条件

大环内酯类药物在酸性条件（pH<4）下苷键易水解，而碱性条件（pH>9）可使内酯环开裂，所以对于蜂蜜中泰乐菌素的前处理选择了pH4～10的磷酸盐提取液进行比较，不同pH值提取液的回收率见图1。由图1可知，提取液pH值为6时，泰乐菌素A的回收率最高，为76%，而脱红霉糖泰乐菌素在pH值为5和6时相差不大，所以最终选择了pH 6的提取液。

图1　不同pH值提取液对泰乐菌素A和脱红霉糖泰乐菌素的回收率

3.2不同温度下成熟蜜和生蜜中泰乐菌素A的稳定性

在成熟蜜（经蜜蜂充分酿造、脱水的蜂蜜，含水量在20%以下）和生蜜（蜜蜂刚采回不久没有经过充分酿造的蜂蜜，水分含量较高）中添加泰乐菌素A标准溶液，添加量为20 μg/kg，搅匀后各分成两份，分别放置于4℃冰箱和室温，选择不同时间检测其中泰乐菌素A的含量，结果见图2。由图2可知，室温放置时，成熟蜜和生蜜中泰乐菌素A含量均在下降，脱红霉糖泰乐菌素含量在逐渐上升，且在生蜜中降解更快；4℃冰箱放置的蜂蜜中的泰乐菌素A含量较稳定。蜂蜜中水分含量和蜂蜜放置温度均对泰乐菌素A的稳定性有影响。

图2　不同温度下成熟蜜和生蜜中泰乐菌素A及其代谢物

3.3方法的线性范围、检测限、添加回收实验和精密度

配制质量浓度为2.0～100μg/L的系列标准溶液，以待测物峰面积 (y)为纵坐标，待测物的质量浓度(x,μg/ kg)为横坐标进行线性回归，均获得良好的线性。标准溶液色谱图见图3，在阴性蜂蜜样品中添加待测物标准溶液，提取净化后进行测定，确定方法的检出限和定量限分别为1.0和2.0μg/kg。在阴性蜂蜜中加入泰乐菌素A及脱红霉糖泰乐菌素标准溶液（添加水平为2.0、5.0和10.0μg/kg），每个水平做6个平行，回收率和精密度数据见表2。采用本方法检测了150个蜂蜜样品，其中一个检出泰乐菌素A，检测结果为4.2 μg/kg。

图3　泰乐菌素A及脱红霉糖泰乐菌素标准溶液色谱图

4　结论

本文研究蜂蜜中泰乐菌素A的稳定性，泰乐菌素A在蜂蜜中会发生降解，生成代谢物脱红霉糖泰乐菌素；同时建立蜂蜜中泰乐菌素A和脱红霉糖泰乐菌素的高效液相色谱串联质谱检测法，方法前处理简单，回收率稳定且重现性较好，能满足日常检测工作的需要。

表2　回收率和精密度试验结果（n=6）

[1]张睿.蜂产品检测技术指南[M].南京：南京大学出版社，2013：85.

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[6]刘永涛，艾晓辉，邹世平，等.水产品中螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素与北里霉素残留量的超高效液相色谱-紫外检测法同时测定.分析测试学报，2010，29（3）：316-320.

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The stability of Tylosin A in honey

Cheng Huilan,Zhang Xiaoyan,Chen Lei,Yin Yao,Ding Tao,Zhu Wenjun,Huang Juan,Yang Wenquan
（National Honey Reference Laboratory,Animal,Plant and Food Inspection Center(APFIC)of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China）

Tylosin A is effective to AFB which is resistant to the antibiotic oxytetracycline and is almost non-toxicity to honeybees.However,tylosin A will remain in honey products if it was overdosed.Honey is weak acidic and tylosin A will degrade in acidic conditions.Therefore,the degradation was studied in honey at different tempeture and the method for determination of tylosin A and the metabolite desmycosin was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The antibiotics was extracted by phosphate buffer(pH6.0)and cleaned-up by HLB.The limit of detection and the limit of quantitation were 1.0μg/kg and 2.0μg/kg,respectively.The recoveries ranged from 70.75%to 89.28%while the precision from 6.4%to 8.9%.The method was used in detection.

honey，tylosin A，desmycosin，stability，high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

陈惠兰，女，高级工程师，主要研究兽药残留检测。

张晓燕，女，高级工程师，主要研究兽药残留检测，E-mail：zhangxy@jsciq.gov.cn。