马链球菌兽疫亚种SeseC-00619蛋白的功能研究

付　强，王爱富，李桂珍，罗惠娜，马春全

(佛山科学技术学院，广东佛山 528231)



研究论文

马链球菌兽疫亚种SeseC-00619蛋白的功能研究

付强，王爱富，李桂珍，罗惠娜，马春全*

(佛山科学技术学院，广东佛山 528231)

为了阐明马链球菌兽疫亚种新蛋白SeseC-00619(细胞表面蛋白,cell surface protein,CSP)的功能，本试验采用real-time qPCR分析CSP的体内诱导表达特征，同时在大肠埃希菌中表达与纯化马链球菌兽疫亚种表面相关蛋白CSP，研究其免疫反应性及免疫保护功能，并试图解释其分子机制。通过流式细胞术与黏附抑制试验探索CSP对小鼠肺上皮细胞的黏附作用。结果表明，CSP是一个重要的体内诱导抗原，并且能在S.zooepidemicus细菌表面表达，属于细菌表面蛋白。重组蛋白CSP能够黏附LA-4细胞表面，而这种黏附作用可以竞争性抑制S.zooepidemicus黏附宿主细胞。本结果为进一步研究CSP基因的功能及其在致病机制中的作用奠定了基础。

细胞表面蛋白；黏附；致病机制

马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequissp.zooepidemicus,S.zooepidemicus) 属于乳杆菌目、链球菌科、链球菌属，能引起猪、马、绵羊、奶牛等多种动物发病，实验动物小鼠、兔等对该菌也极为易感，在我国主要引起猪链球菌病[1-3]。猪链球菌病是危害养猪业的重要细菌性疾病，严重危害我国乃至世界养猪业的发展。

现有的研究对S.zooepidemicus的毒力因子和保护抗原缺乏全面的了解，因此现阶段全面控制S.zooepidemicus感染仍然存在很多困难[4-5]。近年来S.zooepidemicus菌株的基因组测序结果发现，SeseC-00619(cell surface protein,CSP)具有典型LPXTG的细胞壁锚定域，很可能是一种细菌表面蛋白。因为CSP无同源蛋白或与其他蛋白序列无显著的同源性[6]，所以深入研究CSP的功能对阐明S.zooepidemicus的分子致病机制具有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种、载体和细胞马链球菌兽疫亚种菌株、大肠埃希菌基因工程菌株DH5α、大肠埃希菌BL21、表达质粒pET-28a (+)、小鼠肺上皮细胞LA-4均由佛山科学技术学院预防兽医学实验室馈赠。

1.1.2试剂细菌RNA抽提用Trizol试剂，Invitrogen公司产品；DNase Ⅰ，Promega公司产品；Taq酶、限制性内切酶BamH Ⅰ和SalⅠ、T4连接酶、DNA Marker、反转录试剂盒及荧光定量PCR相关试剂，宝生物工程(大连)有限公司产品；UNIQ-10 柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；FITC标记的羊抗鼠IgG-FITC，Santa Cruz Biotechnology公司产品。

1.2方法

1.2.1Real-time qPCR培养至对数生长期的S.zooepidemicus作为体外培养细菌，感染小鼠体内细菌的富集方法按照Fu Q等描述的方法进行[7]。使用Trizol试剂提取体内富集细菌和体外培养细菌的RNA，以DNase Ⅰ去除DNA，反转录试剂盒进行反转录。以回收的CSP和16 S rRNA扩增产物作为标准品，测定其浓度，换算浓度(ng/μL)至拷贝数/μL。对标准品做10倍梯度稀释，稀释的浓度分别为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝数/μL，以其作为模板绘制标准曲线。PCR反应体系(总体积为25 μL)：上、下游引物各0.5 μL，10×SYBR Green real-time PCR Master Mix 12.5 μL，双蒸水 11 μL，cDNA 样品0.5 μL 。每个样品做3个重复。PCR扩增条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s, 55℃ 30 s，共40个循环。整个反应过程中的荧光信号的变化由LightCycler 480 (Roche)实时荧光定量PCR仪检测。按照文献[8-9]描述的2-ΔΔCt方法对荧光定量PCR数据进行统计分析。

1.2.2CSP基因的克隆应用引物设计软件Primer 5.0 软件设计用于扩增CSP基因的引物,两端分别添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位点及保护性碱基。P1：5′- CAATCGCTAATACGGAATTCGAGG -3′；P2：5′- CTTCGTGCGTCGACGCTGGTTTC -3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以CTAB法提取的S.zooepidemicus基因组作为PCR模板，按下列顺序配制反应试剂。反应体系25 μL：2.5 μL的10×buffer，2.5 μL MgCl2，2.5 μL dNTP Mixtrue，10 μmol/L引物各0.5 μLTaqDNA 聚合酶0.1 μL，DNA模板2 μL，加无菌双蒸水至25 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 5 min。用BamHⅠ和SalⅠ同时酶切PCR扩增的产物及pET-28a (+)，回收PCR片段以及载体片段。将回收 PCR片断与 pET-28a(+)连接，转化BL21感受态细胞。

1.2.3重组质粒的诱导表达及纯化将表达菌株接种于添加氨苄青霉素的LB液体培养基，于37 ℃摇床培养。从培养好的菌液中取 100 μL接种于含氨苄青霉素的新鲜 LB液体培养基中，于 37℃振荡培养约3 h，至OD 600 nm 达到0.6～1.0时，添加IPTG至终浓度为0.8 mmol/L，继续培养 3 h后收集菌体。将超声波破碎后的上清液用Ni-NTA亲和树脂纯化。

1.2.4免疫荧光检测用PBS洗3次并调整细菌的密度约为1×108CFU/mL，取5 μL均匀涂在盖玻片上，加入100%的甲醇在-20 ℃固定10 min，然后加入相应的血清200 μL，37 ℃孵育1 h后用PBS洗片3次，加入FITC标记的IgG，37 ℃避光孵育1 h后用TBST洗片3次，风干后固定在载玻片上，用荧光显微镜观察[10]。

1.2.5免疫保护试验将纯化的重组蛋白CSP与Marcol 52佐剂乳化后作为疫苗，浓度为 200 μg/mL，设置佐剂对照(即用生理盐水与等量佐剂乳化制备)和空白对照(只注射生理盐水)。4周龄的雌性Balb/c小鼠(约18 g)每组10只，免疫方法如下：首免腹腔注射佐剂乳化的抗原0.5 mL，2周后腹腔注射免疫佐剂乳化的抗原0.5 mL。二免10 d后进行保护力试验，分别接种相同剂量的S.zooepidemicus(2×105CFU)，连续观察2周，记录小鼠的死亡情况。

1.2.6流式细胞术检测按照Lin L等[11]描述的方法进行流式细胞术检测CSP黏附LA-4细胞，用10 g/L的BSA封闭LA-4细胞，加入10 μg纯化后的重组蛋白CSP，冰上孵育45 min后加入200 μL相应的血清，冰上孵育45 min；于4 ℃ 、2000 r/min离心3 min，弃上清，用500 μL预冷的BSA溶液洗2次，加入FITC标记抗体，冰上孵育45 min；用滤膜过滤后加入到流式管中，上流式细胞仪检测。

1.2.7抑制黏附试验抑制黏附试验参照Chen B等[12]描述的方法进行，往24孔板培养的LA-4细胞加入10 μg纯化后的重组蛋白CSP(加入BSA作为对照)，于37 ℃孵育45 min，然后用PBS洗3次再加入500 μL用DMEM重悬的细菌 (1×107CFU/mL)，于4 ℃孵育2 h；用PBS洗细胞3次后加入1 mL的Triton X-100裂解液，进行细菌计数；蛋白抑制细菌黏附细胞的计算[1-(蛋白处理的CFU/BSA处理的CFU)]×100。

2　结果

2.1Real-time qPCR分析CSP的体内诱导表达

标准品的标准曲线如图1A所示，CSP标准曲线为y=-3.550 5x+34.782，相关系数R2=0.999 3，扩增效率为1.215；16 S rRNA标准曲线y=-3.574 3x+35.907，相关系数R2=0.999，扩增效率为1.214。CSP与16 S rRNA的引物扩增效率基本一致，满足试验要求，表明本试验的real-time PCR能准确反映转录水平。抽提体内感染细菌的 RNA和体外培养细菌的RNA，应用real-time qPCR技术比较感染动物前后CSP表达量的变化，结果见图1B，相对于体外培养的细菌，S.zooepidemicus感染小鼠脾脏分离细菌CSP的mRNA表达上调30倍，表明CSP属于体内诱导增强表达的抗原，很可能在S.zooepidemicus感染宿主过程中发挥重要作用。

2.2CSP纯化后SDS-PAGE鉴定及Western blot 分析

使用Ni-NTA树脂做亲和层析，纯化重组表达的CSP蛋白(融合His标签)，结果见图2。收集的目的蛋白超滤浓缩后，用于后续的试验分析。纯化的重组蛋白用S.zooepidemicus康复血清做Western blot分析，结果如图2所示，纯化后的蛋白能与S.zooepidemicus康复血清反应，出现阳性条带，表明重组蛋白具有较强的免疫原性，可将该蛋白用于S.zooepidemicus攻毒保护力评价。

A.Ct值与标准品模板的线性关系；B.小鼠脾脏富集的细菌的相对表达量

A.Calibration curves generated using the DNA standards for csp and 16 S rRNA；B.The csp collected from spleens of three SEZ-infected mice were upregulated relative to genes culturedinvitro

图1实时荧光定量PCR分析体内诱导表达

Fig.1Quantitation of theinvivo-induced gene transcripts by real-time qPCR

M.蛋白分子质量标准；1.IPTG诱导前的样品；2.诱导后的样品；3.纯化后的样品；4.蛋白与康复血清杂交的结果

M.Protein molecular weight Marker; 1.Non-induced expression products; 2.Induced expression products; 3.Purified proteins; 4.Western blot analysis of recombinant protein with convalescent sera againstS.zooepidemicus

图2纯化重组CSP蛋白的SDS-PAGE鉴定及Western blot 分析

Fig.2SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant CSP

2.3间接免疫荧光试验验证蛋白的表面分布

通过氨基酸序列分析，发现CSP无同源蛋白或与其他蛋白序列无显著的同源性，但是CSP具有典型LPXTG的细胞壁锚定域，很可能是一种细菌表面蛋白。为了证明蛋白是否在细菌的表面表达，使用CSP的抗体进行了间接免疫荧光试验，阴性对照血清作为试验的阴性对照。结果如图3所示，CSP的抗体染色后可以见到细菌表面具有特异性的绿色荧光，而阴性血清染色后未见明显的绿色荧光，表明CSP是免疫原性蛋白且分布于细菌的表面，可将该蛋白用于S.zooepidemicus攻毒保护力评价。

2.4CSP蛋白的保护效力

为了评价CSP蛋白的保护效力，各组小鼠在二次免疫后第10天分别接种相同剂量的S.zooepidemicus(2×105CFU)，评价重组蛋白的免疫保护力。结果见图 4，空白对照组小鼠的死亡率为70%，阴性对照组小鼠的死亡率为60%，而试验组小鼠的死亡率仅为0，表明CSP蛋白具有较高的保护效力。

图3　免疫荧光分析CSP(A和B)与阴性对照(C和D)

2.5CSP蛋白黏附上皮细胞

定量PCR初步评价了CSP在体内诱导表达的特性，暗示这些蛋白在细菌感染宿主过程中可能起到重要作用。为了探讨重组蛋白是否参与细菌黏附LA-4细胞的过程，用流式细胞术检测重组蛋白CSP黏附细胞的功能。结果如图5所示，细胞与重组蛋白孵育，其平均荧光强度显著高于对照组的平均荧光强度，表明重组蛋白CSP可以黏附LA-4细胞。

图4　重组CSP蛋白的保护效力

A.选中的未染色的细胞；B.重组蛋白CSP(空白框)处理及BSA处理(阴影框)细胞的平均荧光强度

2.6CSP蛋白的黏附抑制试验

为了进一步分析CSP蛋白在S.zooepidemicus黏附宿主细胞过程中的作用，本试验进行了黏附抑制试验，CSP蛋白与细胞孵育后，再用S.zooepidemicus感染细胞，计算抑制黏附的效率。结果如图6所示，重组蛋白CSP能抑制75.7%的细菌黏附细胞，这表明CSP在S.zooepidemicus黏附细胞的过程中起到关键的作用。

图6　重组蛋白CSP抑制S.zooepidemicus黏附LA-4细胞

3　讨论

细菌在环境发生改变的时候，可以迅速调整某些基因的表达水平以适应环境的改变，一些毒力相关因子在培养基培养时表达水平低或者不表达，当感染宿主进入宿主体内后被诱导表达[13]。本试验通过实时荧光定量PCR分析CSP在体内、体外的表达情况，结果发现，CSP在S.zooepidemicus感染时上调表达，属于体内增强表达的抗原，暗示CSP在细菌感染宿主过程中可能发挥重要作用，进一步研究CSP在S.zooepidemicus致病过程中的作用有助于更好地阐明该蛋白的功能。

氨基酸序列分析发现，CSP具有典型LPXTG的细胞壁锚定域，是一种细菌表面相关蛋白。本试验通过间接免疫荧光试验进一步证明CSP抗体染色后细菌表面具有特异性的绿色荧光，而阴性血清染色后未发现明显的绿色荧光，说明CSP确实分布于S.zooepidemicus的表面。多种革兰阳性菌的表面蛋白能结合宿主蛋白，这些表面蛋白被认为是潜在的毒力因子，是疫苗研发的疫苗候选[14-16]。此外，纯化后的CSP蛋白能与S.zooepidemicus康复血清反应，表明重组蛋白具有较强的免疫反应性，具有作为疫苗候选的潜力，可进一步将该蛋白用于S.zooepidemicus攻毒保护力评价。试验采用Marcol 52佐剂乳化的CSP免疫小鼠，能够抵御S.zooepidemicus的攻击，无疑是很好的保护性抗原。

CSP能够保提供较高的保护力，可作为疫苗候选抗原。本试验深入探索CSP提供保护效力的机制，通过流式细胞术发现，重组蛋白CSP能够黏附LA-4细胞表面；而黏附抑制试验表明这种黏附功能可以竞争性抑制细菌黏附宿主细胞，可以推测CSP抗体能阻断S.zooepidemicus黏附侵入宿主从而起到保护作用[17]。这些试验结果揭示了CSP可能与宿主的某些基因相互作用，调控S.zooepidemicus黏附宿主上皮细胞过程。而细菌黏附宿主的上皮细胞无疑是细菌突破宿主防御系统的关键步骤，因此，CSP很可能在S.zooepidemicus黏附侵入宿主的过程中起到关键作用。CSP具体的黏附机制以及CSP如何影响致病功能仍未得到阐明，这些问题有待下一步通过构建基因缺失突变菌株及回复突变菌株的研究来阐明。

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Study on SeseC-00619 Function of Streptococcus equi ssp.zooepidemicus

FU Qiang,WANG Ai-fu,LI Gui-zhen,LUO Hui-na,MA Chun-quan

(Foshan University,Foshan,Guangdong,528231,China)

In order to study the function of a protective antigen, SeseC-00619 (cell surface protein, CSP) ofStreptococcusequissp.zooepidemicus(S.zooepidemicus),real-time qPCR was used CSP was inducedinvivofollowing infection of mice withS.zooepidemicus. Immunofl uorescence assay was carried out to confirm that CSP was located at the surface ofS.zooepidemicuscells. The purified recombinant CSP could confer significant protection against challenge with lethal dose ofS.zooepidemicusin mice model. In addition, CSP could adhere to the LA-4 cells confirmed by flow cytometry and inhibit adherence ofS.zooepidemicusto LA-4 cells in an adherence inhibition assay. Our findings encouraged further research for the pathogenesis ofS.zooepidemicusCSP protein.

cell surface protein; adherence; pathogenesis

2016-05-13

国家自然科学基金项目(31502047)；广东省自然科学基金项目(2014A030310020)；广东高校优秀青年创新人才培养计划项目(2014KQNCX179)

付强(1983-)，男，广东英德人，讲师，博士，主要从事动物分子免疫学研究。*通讯作者

S852.611;S858.21

A

1007-5038(2016)08-0001-05