子宫内膜癌患者血清has-miR-141的表达及其临床意义

贾英华　韩瑛　李义　刘芝华　李淑敏#

1清华大学第一附属医院妇产科，北京　100021

国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院2妇瘤科，3分子肿瘤学国家重点实验室，北京　100021

子宫内膜癌患者血清has-miR-141的表达及其临床意义

贾英华1韩瑛2李义3刘芝华3李淑敏2#

1清华大学第一附属医院妇产科，北京100021

国家癌症中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院2妇瘤科，3分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021

目的探讨人类微小RNA-141（has-miR-141）在子宫内膜癌患者血清中的表达及其临床意义。方法收集55例子宫内膜癌患者术前24 h内的血清标本，以同期收治的12例子宫肌瘤患者术前24 h内的血清和5例健康志愿者的血清作为对照组，应用实时荧光定量PCR技术检测子宫内膜癌患者和对照组血清中has-miR-141的表达水平，并分析has-miR-141表达水平与55例子宫内膜癌患者的临床病理危险因素的关系。结果子宫内膜癌患者的血清has-miR-141的表达水平（2.6295±2.038）高于对照组的（1.561±0.695），差异有统计学意义（P＜0.05）。子宫内膜癌患者血清中has-miR-141表达与组织病理分型、淋巴结转移和临床分期诊断有关（P＜0.05），非子宫内膜样癌、淋巴结转移、Ⅲ期+Ⅳ期患者has-miR-141的表达水平高于子宫内膜样癌、无淋巴结转移、Ⅰ期+Ⅱ期患者。不同组织病理分级、年龄、CA125值患者血清中has-miR-141的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论子宫内膜癌患者血清中has-miR-141呈高表达水平，且与淋巴结转移、病理分型及临床分期有关。has-miR-141有可能成为一种诊断子宫内膜癌的新型标志物，同时有可能作为进展期子宫内膜癌的诊断依据，从而为子宫内膜癌的诊断及治疗提供有效帮助。

子宫内膜癌；has-miR-141；血清标志物

Oncol Prog，2016，14（7）

子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在欧美国家其发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤之首［1］。我国子宫内膜癌的发病率也仅次于宫颈癌，且发病率逐年上升，同时呈现年轻化趋势。尽管多数子宫内膜癌患者因异常阴道出血或排液等症状，经术前诊刮病理可及早诊断，但仍有15%～25%的患者诊断时已属晚期。近年晚期患者逐渐增多，预后较差，即使预后好的Ⅰa期子宫内膜癌患者，也有10%出现治疗后复发转移［2-4］。目前临床应用的肿瘤标志物血清CA125还不能有效地监测子宫内膜癌患者的术后复发，且不能用于子宫内膜癌分子分型诊断［5］。血清或血浆中的miRNA可以作为一种筛查恶性肿瘤或用于肿瘤治疗后随诊监测的分子标志物［6］。miRNA在血清和血浆中十分稳定，在健康个体中无明显差异，而疾病对miRNA的表达影响显著，还有研究发现人类微小RNA-141（homo sapiens microRNA-141，hasmiR-141）在子宫内膜癌组织中上调［7］。因此，本研究拟探讨has-miR-141是否在子宫内膜癌患者的血清中表达及其表达水平，并研究其与患者的临床病理危险因素间的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料

收集2011年5月至2012年12月中国医学科学院肿瘤医院收治的55例子宫内膜癌患者术前血清标本。患者中位年龄52岁（39～72岁），手术病理分期按照2009年国际妇产科联盟（FIGO）的分期标准，其中Ⅰ期30例，Ⅱ期7例，Ⅲ期12例，Ⅳ期6例；病理分化程度：高分化20例，中分化21例，低分化14例；子宫内膜样腺癌47例，非子宫内膜样腺癌8例（其中浆液性乳头状腺癌5例，透明细胞癌3例）；有盆腔淋巴结转移者20例。选取同期病理为正常子宫内膜的子宫肌瘤患者的术前血清标本12例，健康志愿者血清标本5例作为对照组，中位年龄43岁（31～49岁）。

1.2主要试剂

RNA试剂盒、Quantscript RT试剂盒购自北京天根公司，SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒购自Takara公司，PCR仪为美国Bio-rad公司生产。

1.3研究方法

1.3.1血清样本的收集与处理取全血3.5 ml到血清真空采血管中，静置30～60 min。常温下离心，2000 rpm，15 min。将上层血清转移至1.5 ml的无RNA酶的EP管中，置于-80℃冰箱冷冻。

1.3.2血清has-miR-141的提取按RNA试剂盒使用说明书提取血清总RNA。

1.3.3血清has-miR-141的定量分析①反转录（RT）：将10×RT缓冲液2µl、超纯dNTP混合液2µl、miR-141反向引物2µl、RT酶1µl、模板RNA 11µl混合，加无酶水至20µl，彻底混匀，漩涡振荡时间不超过5 s，简短离心后，37℃孵育60 min，-20℃冰箱储存备用。②实时荧光定量PCR：取出备用RT产物2µl，与SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10µl、PCR正向引物0.8µl、反向引物0.8µl、ROX Reference DyeⅡ0.4µl混合，加入灭菌蒸馏水7.0µl，经过95℃30 s活化extaq酶，然后95℃5 s、60℃30～ 34 s，共40个循环。has-miR-141特异性PCR引物序列，正向：ACACTCCAGCTGGGCATCTTCCAGTACAGT，反向：CTCAACTGGTGTCGT GGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCAACAC；内参照U6引物序列，正向：CTCGCTTCGGCAGCACA，反向：AACGCTTCACGAATTTGCGT；URP引物：URP-TGGTGTCGTGGAGTCG。③has-miR-141表达水平的计算方法：以U6为内参照，测定循环阈值（CT值），计算△CT值，△CT=hsa-miR-141平均CT值-U6平均CT值，△△CT=△CT子宫内膜癌组-△CT对照组，以2-△△CT表示has-miR-141的表达水平，设对照组血清has-miR-141的表达水平为1，以此为对照计算子宫内膜癌患者血清has-miR-141的表达水平。

1.4统计学分析

数据处理均采用Graphpad Prism 5软件进行。子宫内膜癌患者及对照组中has-miR-141的相对定量为非正态分布，经对数转换后成为-正态分布。所有实验数据结果用均数±标准差（x±s）表示，两样本比较采用双尾非配对t检验，三样本间比较采用one way ANOVA检验方法分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1has-miR-141在子宫内膜癌患者血清中的表达情况

55例子宫内膜癌组患者的血清has-miR-141的相对表达量为（2.6295±2.038），明显高于17例对照组的（1.1561±0.695），差异具有统计学意义（t= 2.9165，P＜0.05）。而对照组中的12例良性子宫肌瘤患者与5例健康志愿者的血清has-miR-141的表达水平比较，差异无统计学意义（t=1.9913，P＞0.05）。（表1）

表1　子宫内膜癌组及对照组血清标本中has-miR-141 的表达情况（±s）

表1　子宫内膜癌组及对照组血清标本中has-miR-141 的表达情况（±s）

注：*与健康志愿者组比较，P＞0.05；#与对照组比较，P＜0.05

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2.2血清has-miR-141的表达与子宫内膜癌患者的临床病理危险因素的关系

本研究将55例子宫内膜癌患者按组织病理分型、病理分级、淋巴结是否转移、临床分期、年龄（＞50岁和≤50岁）、CA125（＞35 U/ml和≤35 U/ml）进行分组，比较各组患者血清中has-miR-141的表达水平。子宫内膜癌患者血清中has-miR-141表达与组织病理分型、淋巴结转移和临床分期诊断有关（P＜0.05），非子宫内膜样癌、淋巴结转移、Ⅲ期+Ⅳ期患者has-miR-141的表达水平高于子宫内膜样癌、无淋巴结转移、Ⅰ期+Ⅱ期患者。不同组织病理分级、年龄、CA125值患者血清中has-miR-141的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

表2　子宫内膜癌患者血清中has-miR-141 表达与临床病理因素的关系

3　讨论

CA125被认为是子宫内膜癌最有价值的血清肿瘤标志物［8］，虽然其对早期子宫内膜癌的诊断价值不大，但是它与肿瘤的分期、组织学分级、肌层浸润深度、子宫外淋巴结转移等相关，可作为预后判断的重要指标之一，也可用于肿瘤复发的监测［9-10］。

miRNA是近年来发现的一种非编码小分子RNA，能特异性抑制靶miRNA，在基因表达转录后调控中发挥关键的作用，且以往在研究肿瘤miRNA时都是对组织及细胞内miRNA进行研究。近年研究发现在血清和血浆中存在等量的miRNA，这些miRNA十分稳定，不容易被血液内源性和外源性RNases降解，能耐受较酸和较碱环境。此外，不同健康个体的循环miRNA表达水平相当一致，没有明显个体差异，而疾病可显著影响循环中miRNA的表达［11］。因此，近年miRNA作为潜在的肿瘤分子标志物，尤其是血清或血浆中的miRNA在肿瘤诊断中的价值受到越来越多医学工作者的关注。

miR-141属于miR-200家族。除miR-141外，miR-200家族还包括miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-429。miR-141作为miR-200家族的成员之一，在结直肠癌、前列腺癌、胆管癌等的组织及细胞株中表达增高，提示miR-141与多种肿瘤的发病机制相关［12-14］。miR-141基因在染色体上的位置为12p13.31，研究表明其功能类似于癌基因，BRD3、UBAP1和PTEN是其主要的作用靶点，BRD3、UBAP1主要与鼻咽癌的发生密切相关，而PTEN是许多肿瘤的主要抑癌基因［15］，提示miR-141可能通过改变细胞的增殖和侵袭特征参与肿瘤的发生和发展过程。在人类肿瘤疾病中miR-141的高表达以及针对多种重要抑癌基因的调节作用表明miR-141有望成为新的肿瘤标志物。

Garzon等［16］采用miRNA基因芯片技术检测出has-miR-141在子宫内膜癌组织中上调，同时另有研究发现癌细胞和血清中miRNA的相关性较高，血清中肿瘤相关的miRNA来自于肿瘤组织。基于以上研究，我们猜测子宫内膜癌组织中高表达的has-miR-141很有可能进入到血液中并被检测，从而有可能成为一个新的子宫内膜癌检测的肿瘤标志物。

本研究发现has-miR-141在子宫内膜癌患者血清中的表达高于对照组，提示检测血清has-miR-141可能对子宫内膜癌的诊断具有一定临床意义。同时研究发现has-miR-141对子宫内膜癌的组织病理分型判断、是否淋巴结转移及病情程度预测都有一定价值，尤其与子宫内膜癌淋巴结的转移密切相关，有可能作为进展期子宫内膜癌的诊断依据，从而为子宫内膜癌的早期诊断及治疗提供有效帮助，弥补CA125等其他诊断方法在早期诊断中的不足。研究还提示子宫内膜癌患者血清has-miR-141的表达与其病理分化程度无关（P＞0.05），但这可能是由于研究中子宫内膜癌病例数较少所致，尚需扩大样本进一步研究。

我们期待子宫内膜癌血清miRNA表达谱的建立，根据表达谱筛选出差异明显的一个或多个miRNA，进行大样本验证，选择表达差异最明显的miRNA分子最终用于筛选子宫内膜癌患者或有淋巴结转移的子宫内膜癌患者，并按照个体化治疗原则进行干预治疗，以期降低局部复发率及远处转移率，改善预后。

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Expression of has-miR-141 in serum of patients with endometrial cancer and the clinical significance

JIAYing-hua1HAN Ying2LI Yi3LIU Zhi-hua3LI Shu-min2#>
1Department of Obstetrics and Gynecology，First Hospital of Tsinghua University，Beijing 100021，China
2Department of Gynecologic Tumor，3National Key Laboratory，National Cancer Center/Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China

ObjectiveTo investigate the expression of the has-miR-141 in the serum of patients with endometrial cancer and the clinical significance.Method55 blood samples from patients with endometrial cancer，and in the same period 12 serum samples from patients with hysteromyoma were collected within 24 h before surgery，while another 5 blood samples were collected from healthy volunteers as control，then real-time quantitative PCR was used to detect the expression of has-miR-141 in those specimens，and the correlation between clinical pathological risk factors and the expression of has-miR-141 in 55 cases of endometrial cancer was analyzed.ResultThe expression of has-miR-141 in endometrial cancer patients（2.6295±2.038）was significant higher than that in control group（1.561±0.695）（P＜0.05）.The expression of has-miR-141 was closely related with pathological types，lymph node metastasis and clinical staging（P＜0.05）.The expressions in patients with non-endometrioid adenocarcinoma，lymph node metastasis and at stage III-IV were higher than those with endometrioid adenocarcinoma，without lymph node metastasis and at stage I-II.The expressions were of no statistically significant difference（P＞0.05）in patients with different histopathological stages，age and CA125 levels.Conclu-sionThe has-miR-141 is highly expressed in the serum of patients with endometrial cancer，and is closely related with lymph node metastasis，pathological types and clinical staging，making it a promising alternative predictor in diagnosis of endometrial cancer，furthermore it may play a role in determining the progression of advanced endometrial cancer，providing evidence for the early diagnosis and treatment of endometrial cancer.

endometrial cancer；has-miR-141；serum marker

R737.33

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.07.12

2015-10-26）

（corresponding author），邮箱：2230350570@qq.com