酶促合成二氢杨梅素酯化物及其纯化的研究

吴　欢， 李　卫， 郭　巍， 陈爱洋， 朱　林， 万端极

(1湖北工业大学资源与环境工程学院， 湖北 武汉 430068; 湖北 武汉 430068; 2湖北工业大学食品与制药工程学院， 湖北 武汉 430068)



酶促合成二氢杨梅素酯化物及其纯化的研究

吴欢1， 李卫2， 郭巍1， 陈爱洋1， 朱林1， 万端极1

(1湖北工业大学资源与环境工程学院， 湖北 武汉 430068; 湖北 武汉 430068; 2湖北工业大学食品与制药工程学院， 湖北 武汉 430068)

采用雪白根霉脂肪酶催化二氢杨梅素和乙酸乙烯酯合成二氢杨梅素单酯化物，探索不同溶剂作为酶促酯化的反应体系，确定最佳的反应体系为：以乙腈为溶剂，雪白根霉脂肪酶的量为500 U，乙酸乙烯酯与二氢杨梅素的物质的量之比为15～20，温度45℃，时间24～36 h。二氢杨梅素转化率最高可达83.6%，利用薄层层析法分离出二氢杨梅素单酯化物的条件：V(氯仿)∶V(丙酮)∶V(乙酸)=60∶38∶2，二氢杨梅素单酯化物的纯度可达96%。

二氢杨梅素； 脂肪酶； 酯化反应； 转化率

二氢杨梅素占藤茶茎叶干重的30%以上，是藤茶的主要活性物质[1]，其特殊结构决定它具有一定的亲水性，而油溶性较差，导致其抗氧化活性和抑菌性等作用在多种应用方面受到限制[2]。研究表明，选择合适的酰化剂对二氢杨梅素进行酯化反应，可解决其难溶于油的问题，其抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等活性也会有所增强[3]。

本研究首次将雪白根霉脂肪酶作为催化剂，研究乙腈、丙酮、四氢呋喃、叔丁醇、二甲基亚砜等作为溶剂，以及底物摩尔比、温度、酶量和时间等不同因素对反应的影响，将二氢杨梅素转化率和初始转化率作为考察指标，选取最佳反应条件。考查薄层层析法分离出二氢杨梅素单酯化物的条件，为二氢杨梅素酯化物的工业化酶催化合成二氢杨梅素酯化物的生产和应用提供理论基础。

1　实验部分

1.1实验材料与主要仪器

主要原料和试剂：二氢杨梅素，纯度98%；甲醇，色谱纯；乙酸乙烯酯，分析纯；乙腈，分析纯；丙酮，分析纯；四氢呋喃，分析纯；叔丁醇，分析纯；二甲基亚砜，分析纯；冰乙酸，分析纯。

主要仪器和设备：恒温空气浴摇床TS-211B，北京天翔仪器设备有限公司；台式高速离心机TLL-C，上海精密仪器仪表公司；真空干燥箱DZF-6050，北京兴争仪器设备厂；高效液相色谱仪UltiMate3000，上海禾木仪器有限公司；Nexus-870傅立叶变换红外光谱仪，海雪弘仪器有限公司；安捷伦6240质谱-1200液相，上海雪弘仪器有限公司。

1.2二氢杨梅素酯化物合成方法

在10 mL带塞三角瓶中各加入2 mL溶剂，加入一定量的乙酸乙烯酯和二氢杨梅素，在合适温度和转速的条件下，反应一定时间，取样，用甲醇水溶液稀释至100倍，离心(15 000 r/min)15 min后，取上清液(20 μL)，供高效液相色谱分析。

高效液相色谱的检测方法：流动相A为乙腈，流动相B为0.1%的乙酸水溶液；梯度洗脱程序：0～8 min，28%～30%乙腈；8～15 min，30%～80%乙腈；15～25 min，80%～28%乙腈(体积比)；流速为1 mL/min；进样量20 μL。

二氢杨梅素转化率的计算：根据二氢杨梅素峰面积的减少量与反应前二氢杨梅素峰面积比值。

反应初速度：根据反应初始阶段单位时间内底物的峰面积减少量来计算初始反应速度。

1.3二氢杨梅素酯化物的分离纯化方法

将大小合适的玻璃板用乙醇和丙酮洗净搽干。取适量薄层色谱用的硅胶用蒸馏水调成糊，用杵碾磨0.5 h后，将碾磨好的糊状物涂抹在玻璃板上，振动使糊状物在玻璃板上摊平，晾干。使用前放入105～115℃烘箱进行活化40～50 min后，冷却后使用。取少量的丙酮将样品溶解，在距薄层板底边1～2 cm画好基线，用毛细管蘸取溶解好的样品液，在薄层板基线上点样，根据实际情况可多次点样，样点直径在1～1.5 mm之间，将薄层板垂直放入盛有展开剂(V(氯仿) ∶V(丙酮) ∶V(乙酸)=60∶38 ∶2)的有盖展开瓶中，盖上瓶盖。待目标物上升到合适高度，取出薄层板，在紫外灯下显色或用10%FeCl3使其显色。计算各组分的相对移动值。

1.4二氢杨梅素酯化物的分子鉴定

1.4.1红外图谱分析FT-IR检测：在玛瑙研钵中加入1～2 mg取纯化后的产物进行研细，后在研钵加入约100～200 mg溴化钾粉末，一起研磨至2 μm以下且混合均匀，转移至模具中，按顺序放好各部件后，置于压片机中抽真空5 min，然后边抽气边加压，当压力达到68.6 MPa时，停止加压，维持5 min后，解压，当压力表指针为“0”，取出模具，即得透明的晶片。以空气为对照，用红外光谱仪分析。

1.4.2质谱分析质谱分析条件：将纯化后的产物用乙腈溶解，二氢杨梅素作为对照组，分别配置浓度为2μmol/L的溶液，采用电喷雾电离源(ESI)正离子模式检测，电喷雾电压为3.0 kV；电喷雾接口干燥气(NZ)流速为3 181 L/h，脱溶剂温度为250℃；碰撞诱导解离电压为30 V；离子源温度为120℃。

2　结果与讨论

2.1溶剂的影响

在5个10 mL带塞三角瓶中各加入2 mL溶剂(乙腈、丙酮、四氢呋喃、叔丁醇、二甲基亚砜)、20 mmol/L二氢杨梅素、500 mmol/L乙酸乙烯酯(VA)和500 U雪白根霉脂肪酶，混合均匀，摇床设定温度为40℃、转速200 r/min，反应24 h，取样分析。结果见表1。

一般认为，酶在疏水性溶剂中的催化活性比在亲水性溶剂中高，因此酶反应在非极性溶剂中更易进行。但对于疏水性较强的有机溶剂，由于疏水底物的溶剂化使底物不易从溶剂中扩散到酶分子周围，酶活力就降低[4]。可见疏水性对反应的影响是多方面的。对于本研究而言，选择溶剂时必须充分考虑底物在不同溶剂中的溶解特性。

表1结果表明，二氢杨梅素在乙腈中的溶解度最低，然而，二氢杨梅素的转化率最高，在叔丁醇中的转化率最低。在这几种有机溶剂中，溶剂疏水常数和二氢杨梅素在溶剂中的溶解度与酯化反应没有相关性。

表1　二氢杨梅素(DMY)在不同有机溶剂中的转化率及其它参数

2.2底物摩尔比对酶促酯化反应的影响

在6个10 mL带塞三角瓶中分别加入2 mL乙腈，20 mmol/L二氢杨梅素、不同摩尔浓度的乙酸乙烯酯(乙酸乙烯酯与二氢杨梅素的物质的量之比为：3、7、10、15、20、25)和500 U雪白根霉脂肪酶，混合均匀，摇床设定温度为40℃、转速200 r/min，反应36 h，取样分析。结果见图1。

图 1　底物物质的量之比对酶促酯化反应的影响

由图1可知，当底物物质的量之比低于10时，随着该比值的提高，反应的初速度和底物转化率均迅速提高；当物质的量之比超过10时，随着该比值的升高，反应初速度和相同时间内的底物转化率仍呈增加的趋势，但增加的幅度开始趋于缓和；当底物物质的量之比高于20时，反应转化率增加较缓慢，初速度趋于平稳，此时，底物物质的量之比对反应初速度和底物转化率的影响较小。综合考虑，认为酶促二氢杨梅素乙酯化反应的最适底物物质的量之比为15～20。脂肪酶催化二氢杨梅素与乙酸乙烯酯的酯化反应属于双底物反应，在所研究的浓度范围内，未发现乙酸乙烯酯或二氢杨梅素对雪白根霉脂肪酶有明显的抑制作用。

2.3反应温度对酶促酯化反应的影响

在5个10 mL带塞三角瓶中分别加入2 mL含20 mmol/L二氢杨梅素、500 mmol/L乙酸乙烯酯的乙腈溶液，加入500 U雪白根霉脂肪酶，混合均匀，分别设置摇床的温度为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，振荡速率都设置为200 r/min，反应36 h后取反应液分析。结果见图2。

图 2　反应温度对酶促酯化反应的影响

为了揭示温度对有机溶剂中酶促催化二氢杨梅素定位选择性酯化反应的影响规律，对比研究30～50℃范围内的酶促二氢杨梅素与乙酸乙烯酯的酯化反应。由图2可知，在30～45℃内，酶促二氢杨梅素乙酯化反应的初速度随之增大，这或可归因于：1)底物的溶解度增大；2)酶分子与底物分子之间在单位时间内有效碰撞增多，结合速度加快；3)反应介质的粘度下降，使传质阻力减小[5]等。当温度高于45℃时，再提高温度对反应影响不大。

2.4酶量对酶促酯化反应的影响

在6个10 mL带塞三角瓶中分别加入2 mL乙腈、20 mmol/L二氢杨梅素、500 mmol/L乙酸乙烯酯和不同量的雪白根霉脂肪酶(50 U、100 U、250 U、500 U、750 U、1000 U)，混合均匀，摇床设定温度为40℃、转速200 r/min，反应36 h后取样分析。结果见图3。

在有机溶剂中，脂肪酶的加入量对反应转化率有很大影响。酶能通过瞬时地与反应物结合成过渡态从而降低反应所需的活化能[6]，增加活化分子的数量，使反应的速率提高，在较短的时间内达到化学平衡，使转化率达到最大值。

图 3　酶量对酯化反应的影响

图3表明，当酶量低于500 U时，反应速度的增加趋近于线性增长，说明雪白根霉脂肪酶对二氢杨梅素的酯化反应的催化效率较高，当继续增大酶量超过500 U时，反应速度增长趋缓慢，转化率趋于最大值，由于平衡不移动，故转化率增加不明显。综合考虑反应速度、底物转化率和成本等因素，酶量以500 U为宜。

2.5反应时间酶促酯化反应的影响

在6个10 mL带塞三角瓶中分别加入2 mL含20 mmol/L二氢杨梅素、500 mmol/L乙酸乙烯酯的乙腈溶液，加入500 U雪白根霉脂肪酶，混合均匀，摇床设定温度为40℃、转速200 r/min，取反应时间分别为1 h、5 h、9 h、12 h、24 h、48 h的反应液50 μL，供高效液相色谱分析。结果见图4。

反应的时间达到临界时，合成量趋于平衡，延长时间对反应的影响不大，由于酶被饱和达到了最大催化力；另一方面是由于底物的积累出现逆反应的发生[7]，因此，当反应达到一定时间后，随着时间的增加，合成量渐渐趋于稳定。

图 4　反应时间对酯化反应的影响

由图4可知，反应24 h以前，二氢杨梅素转化率迅速增长。当反应超过24 h后，延长反应时间对于二氢杨梅素转化率几乎没有影响，酯化反应存在逆反应，而长时间进行反应，生成的酯化物会被催化水解而使产物分解[8-10]。因此，考虑转化率和能耗，反应时间控制在24～36 h较好。

2.6二氢杨梅素酯化物的分离纯化

薄层层析能够快速分离样品，根据各组分性质不同，展开的距离也不同[9]，二氢杨梅素酯化物薄层斑点照片见图5，二氢杨梅素及其单酯和多酯的Rf值分别是0.320、0.604和0.792。

图 5　酯化粗产物的薄层层析图

2.7二氢杨梅素酯化物结构分析

2.7.1红外分析从图6可以看出，二氢杨梅素在3200～3600 cm-1处有一个较宽的峰，这是羟基特征吸收峰，由于羟基之间强烈的氢键作用，所以峰形较宽[11]。在1739 cm-1处有较明显羰基的特征吸收峰，红外光谱对照图充分证明二氢杨梅素经过了酰化反应产生酯化物。

(a)DMY红外图谱

(b)DMY酯化物红外图谱图 6　DMY及其酯化物的红外图谱

2.7.2质谱分析采用电喷雾电离法(ESI)的液质联用分析近年来应用颇多。该方法灵敏度和可靠性更高,且较之传统的红外光谱更为简便，不需对照品或标准样品就可对复杂化合物成分进行分析。已知二氢杨梅素的分子量为320，从质谱数据可以看出，二氢杨梅素质谱图中显示分子量为320，另一个图谱显示峰分子量为363，应该是二氢杨梅素单乙酸酯。

图 7　二氢杨梅素质谱图

图 8　二氢杨梅素单酯化物质谱图

3　结论

1)选择合适的酰化剂，不影响二氢杨梅素的抗氧化活性，使之具备更好的脂溶性是一个非常值得研究的课题。本实验选取雪白根霉脂肪酶作为催化剂在一定的条件下，酶量为500 U，底物物质的量之比为1∶20，反应温度为45℃，反应时间控制在36 h。二氢杨梅素的转化率最高可达83.6%。脂肪酶催化具有较高的区域选择性特点，其催化转化率远远高于普通的化学催化法，使用后的脂肪酶,进行活化后可重复利用多次,仍具有一定的催化效果。

2)可将长链脂肪酸特别是具有保健功效的长链不饱和脂肪酸引入到二氢杨梅素分子上，通过选择适当的酰化剂、溶剂系统及脂肪酶以获得更理想的酯化产物。

[1]张友胜,宁正祥,胡闫勇.黄酮类化合物二氢杨梅素的研究利用现状[J].中成药, 2002,24(12): 970-972.

[2]何桂霞,裴刚,周天达，等.显齿蛇葡萄中总黄酮和二氢杨梅素的测定[J]. 中国中药杂志, 2000, 25(7): 423-425.

[3]李卫,郑成,宁正祥.二氢杨梅素月桂酸酯在猪油中的抗氧化性研究[J]. 食品科学, 2005,26(9): 73-76.

[4]孙燕,夏木西·卡马尔.酶促反应合成棕榈酸Vc酯[J].生物技术, 2005,25(2):37-40.

[5]Pan X J,Niu G. Comparison of microwave -assisted extraction and conventional extraction techniques for the extraction of tanshinones from Salvia miltiorrhizabunge [J]. Biochemical Engineering Journal, 2002, 12: 71-77.

[6]Margolin A L. Stereoselectiveoligomerization catalyzed by lipases in organic-solvents [J]. Tetrahedron Letters, 1987, 28(15): 1607-1610.

[7]张友胜,肖更生,陈卫东.二氢杨梅素硬脂酸酯的合成及其抗油脂氧化特性研究[J]. 天然产物研究与开发, 2006, 18: 260-262.

[8]Trubiano G,Borio D.Influence of the operation conditions and the external mass transfer limitation on the synthesis of fally acid esters using a candida antarctica lipase[J].Enzyme and Microbial Technology,2007,40:716-722.

[9]Woo H J,Kang H K,Thanh H N,et al. Synthesis and characterization of ampelopsinglucosides using dextransucrasefromLeuconostocmesenteroides B-1299CB4: Glucosylation enhancing physicochemical properties [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2012, 51: 311-318.

[10] 张友胜,肖更生,陈卫东.二氢杨梅素硬脂酸酯的合成及其抗油脂氧化特性研究[J]. 天然产物研究与开发, 2006, 18: 260-262.

[11] Qing G，Zeng J H，Yao L，et al.Effects of solubility, thermal stability and antioxidant properties of Acylatingdihydromyricetin [J]. Advanced Materials Research, 2013, 791-793:101-105.

[责任编校： 张众]

The Purification and Synthesis of Dihydromyricetin Esters by Lipase

WU Huan1, LI Wei2, GUO Wei1, CHEN Aiyang1, ZHU Lin1

(1SchoolofResourcesandEnvironmentalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China; 2SchoolofFoodandPharmaceuticalEngin.,HubeiUniv.ofTech.,Wuhan430068,China)

Dihydromyricetin esters is achieved with dihydromyricetin and vinyl acetate by lipase catalyzed synthesis. The best system for the enzymatic esterification reaction is explored by different solvents. The best system is determined: Acetonitrile as a solvent. The appropriate amount of Lipase is RN 500U. The optimum substrate molar ratio (Dihydromyricetin: vinyl acetate) 1:15 ～ 1:20. Optimum reaction temperature is 45℃. The reaction time is better controlled in 24 36h. Under the optimal reaction conditions, Dihydromyricetin conversion rate could reach 83.6%. The separation condition was investigated. The results show that chloroform: acetone: acetic acid = 60: 38: 2(by volume).The purity of dihydromyricetin esters can reach up to 96%.

dihydromyricetin；lipase RN；esterification；conversion rate

2016-04-11

“十二五”国家科技支撑计划(2012BAD33B03)；湖北省自然科学基金项目(2008CDZ001)；湖北工业大学高层次人才启动基金项目(BSQD0814)

吴欢(1990-)， 女，湖北黄冈人，湖北工业大学硕士研究生，研究方向为天然产物的提取分离纯化

万端极(1953-)，男，湖北枝江人，湖北工业大学教授，研究方向为膜技术应用，清洁生产工艺，天然产物提取与分离纯化

1003-4684(2016)04-0089-04

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