异欧前胡素对人胃癌BGC-823细胞的凋亡诱导作用的研究

王廷祥　娄国强　施军平



·论著·

异欧前胡素对人胃癌BGC-823细胞的凋亡诱导作用的研究

王廷祥娄国强施军平

目的探讨异欧前胡素对人胃癌BGC-823细胞的凋亡诱导作用。方法以体外培养人胃癌BGC-823细胞和裸鼠荷人胃癌模型为观察对象，采用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法观察异欧前胡素对人胃癌BGC-823细胞的增殖存活率及诱导凋亡能力的影响，并且通过裸鼠成瘤实验观察异欧前胡素对BGC-823细胞的增殖生长情况。结果人胃癌BGC-823细胞系的增殖存活率随着异欧前胡素浓度的提高或者处理时间的增加呈下降趋势，增殖存活率与异欧前胡素呈剂量-时间依赖性；异欧前胡素可以明显诱导BGC-823细胞发生凋亡，且在一定范围内随着异欧前胡素浓度的提高，凋亡率也随之升高；有效剂量的异欧前胡素瘤体内注射能够缩小裸鼠瘤体体积，增加瘤体抑制率，与对照组相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论异欧前胡素能够有效抑制人胃癌BGC-823细胞的增殖并诱导其凋亡，抑制胃癌细胞移植瘤的生长，但对于其具体的调控机制有待进一步研究。

异欧前胡素；胃癌；增殖；凋亡

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，尽管目前临床上采取包括手术切除、化学治疗、放射治疗、基因治疗等在内的综合治疗策略，但胃癌患者的总体生存率仍然较低[1]。据中国肿瘤监测数据显示，目前胃癌居中国肿瘤发病谱第2位，肿瘤死因谱第3位[2-3]。因此，寻找新的高效、低毒药物以及治疗靶点在晚期胃癌的治疗中显得尤为迫切和重要。传统中药具有提高患者免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡，直接杀伤肿瘤细胞，逆转多药耐药等多种机制[4-5]，因此，从天然物质中寻找不良反应小、安全有效的抗肿瘤药物是近年来的研究热点。

异欧前胡素(Isoimpemtorin)属于6，7-呋喃香豆素类(分子式：C16H14O4)，广泛分布于植物界，尤其在伞形科常用中药如白芷、独活、前胡、羌活、北沙参等中含量丰富，并且是其主要的药理效应成分。香豆素类化合物具有较高的应用价值和较多的生物学活性，目前研究发现异欧前胡素具有镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤、舒张心血管等多种生物学特性，对多种肿瘤细胞系都具有明显的凋亡诱导效果[6-7]。但目前关于异欧前胡素对人胃癌BGC-823细胞的凋亡诱导作用尚未见报道。因此，本研究以人胃癌BGC-823细胞作为研究对象，观察异欧前胡素对其增殖、凋亡的影响。

1　材料

1.1动物及细胞株

6只雌性裸鼠，4～6周龄，质量18～20 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：SCXK(沪)2012-0002。人胃癌细胞株BGC-823细胞，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2药品与试剂

GIBCO○RRPMI 1640细胞培养基(美国Invitrogen Life Technologies公司)；GIBCO○R胎牛血清(美国Invitrogen Life Technologies公司)；蛋白浓度测定试剂盒(美国Bio-Rad公司)；HRP标记的抗兔、抗小鼠免疫球蛋白G(IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司)；抗鼠IgG(美国Millipore公司)；胰岛素(江苏万邦生化医药股份有限公司)；蛋白酶抑制剂鸡尾酒试剂盒(美国Pierce公司)；细胞培养皿、孔板(德国Greiner公司)；PVDF膜(美国Bio-Rad公司)；显影定影液(美国Kodak公司)；MTT(美国Sigma公司)。动物实验用异欧前胡素溶液(20 mg/mL)：称取0.02 g异欧前胡素粉末，溶解于1 mL二甲基亚砜(DMSO)中，使用时用生理盐水稀释成不同剂量浓度，超声助溶，分装，室温避光保存。

1.3仪器

倒置显微镜(德国Leica公司)；二氧化碳培养箱(德国Heraeus公司)；PURELAB Classic 纯水系统(美国Pall公司)；CBN8-30型水浴锅(美国Heto公司)；全波长酶标仪(美国Bio-Rad公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；Pico/Fresco离心机(德国Sorvall公司)；Legend RT低温水平离心机(德国Sorvall公司)；BD FACSCalibur流式细胞仪、细胞获取软件及分析软件(美国BD公司)。

2　方法

2.1细胞培养

将人胃癌BGC-823细胞接种于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，放入37℃、相对湿度90%、含5%CO2的培养箱中培养。细胞生长良好，呈单层贴壁生长，每2～3 d换液1次。实验前在倒置显微镜下观察，细胞形态良好，无退化，细胞长满贴壁即可传代，每3 d传代1次，经消化传代后处于指数生长期备用。

2.2MTT法检测人胃癌BGC-823细胞增殖抑制情况

取处于指数生长期的BGC-823细胞，将其铺至96孔板，每孔10 000个细胞，在血清饥饿24 h后加入相应浓度的异欧前胡素处理24 h或48 h，经药物处理后各孔加入MTT(500 mg/L)100 μL，继续培养4 h，然后弃上清，加入DMSO 200 μL，摇床上轻轻振荡待甲臜沉淀完全溶解。采用酶标仪检测各孔OD值(490 nm)，根据公式：细胞抑制率=(OD对照组-OD给药组)/OD对照组×100%，计算出各组细胞的增殖存活率。

2.3Annexin V-FITC/PI双染法检测人胃癌BGC-823细胞的凋亡

将对数生长期的细胞接种于六孔板，24 h后加入药物进行处理，并用不含EDTA的胰酶消化收集细胞，然后用PBS缓冲液洗涤细胞2次，1 000 rpm离心5 min，吸除上清液，并按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书的要求进行操作。结果判断：在双变量流式细胞仪的散点图上，以Annexin V-FITC为横轴，PI为纵轴。左上象限为机械性损伤细胞；左下象限显示活细胞，即(FITC-/PI-)；右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞，即(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，即(FITC+/PI-)。

2.4裸鼠成瘤实验

将6只雌性裸鼠随机分为观察组(异欧前胡素10 mg/kg)和对照组(生理盐水)，每组3只，称量体质量，编号；将BGC-823细胞重悬于无血清RPMI 1640培养基中，按照2×106/鼠的细胞数量，接种于裸鼠俯卧位右前肢皮下；接种后72 h开始给药，两组裸鼠分别给予生理盐水、异欧前胡素10 mg/kg进行处理，给药方式为瘤内注射[8]，每72 h给药1次；每次给药前测量肿瘤体积；连续给药6次，停药24 h后，称量裸鼠体质量，拍照并处死裸鼠，取出肿瘤组织进行称量，肿瘤体积和肿瘤体积抑制率计算公式参考文献[9]，具体如下：肿瘤体积V=L×I2×0.5，L为肿瘤长径，I为肿瘤宽径；肿瘤体积抑制率=[1-(观察组平均肿瘤体积/对照组平均肿瘤体积)]×100%。

3　统计学方法

4　结果

4.1异欧前胡素对胃癌BGC-823细胞增殖抑制的影响

采用MTT法测定人胃癌BGC-823细胞在异欧前胡素处理下的细胞存活能力，观察经不同浓度异欧前胡素处理24 h和48 h的细胞增殖存活率，发现BGC-823细胞系的增殖存活率随着异欧前胡素浓度的增加呈下降趋势。见图1。研究又观察了采用10 μmol/L异欧前胡素处理不同时间后的细胞增殖存活率，发现BGC-823细胞系的增殖存活率随着处理时间的增加呈下降趋势。见图2。

4.2异欧前胡素对胃癌BGC-823细胞凋亡的影响

上述MTT结果提示，异欧前胡素对BGC-823细胞的毒性与药物浓度呈正比。进一步采用Annexin V-FITC/PI双染法经流式细胞仪检测人胃癌BGC-823细胞经不同浓度异欧前胡素处理6 h后的细胞凋亡情况。结果显示，10 μmol/L组BGC-823细胞的凋亡率为10.77%，100 μmol/L组的

凋亡率为19.12%，两组相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图1不同浓度的异欧前胡素处理24 h和48 h后BGC-823细胞的增殖存活率

图210 μmol/L异欧前胡素处理BGC-823细胞不同时间后的增殖存活率

图3　Annexin V-FITC/PI双染法检测不同浓度异欧前胡素对人胃癌BGC-823细胞凋亡的影响

4.3异欧前胡素对胃癌BGC-823细胞移植瘤的影响

上述研究发现，异欧前胡素在体外对人胃癌BGC-823细胞具有存活抑制及诱导凋亡的作用。通过对裸鼠皮下注射BGC-823细胞建立了裸鼠荷人胃癌细胞动物模型。观察10 mg/kg异欧前胡素对BGC-823细胞在裸鼠体内增殖生长情况的影响。将人胃癌BGC-823细胞接种于裸鼠右下背侧皮肤后，第3天均长出皮下结节，观察组和对照组移植瘤体积均达100 mm3，且两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。之后观察组每隔3 d予以10 mg/kg异欧前胡素行瘤内注射，对照组予以相同剂量生理盐水瘤内注射。干预后，观察组瘤体显著被抑制，在第18天时，与干预前体积相比较，观察组瘤体体积减小了43%，对照组瘤体体积减小了30%，两组差异具有统计学意义(P<0.05)。见图4。第18天时，观察组瘤体的体质量为(408±37.75) mg，对照组瘤体的体质量为(727±110.48) mg，两组差异具有统计学意义(P<0.05)。

图4　两组第18天时裸鼠成瘤的体积

5　讨论

2015年世界卫生组织发布的全球肿瘤报告指出，胃癌在所有肿瘤类疾病中的病死率占第3位。在中国，胃癌的发病数与病死数均接近全球胃癌发病总数及病死总数的50%[10-11]。对于中晚期胃癌患者而言，即使进行了有效的外科手术切除，患者的临床预后仍不佳，严重威胁着人们的健康和生命。在中国胃癌恶性程度较高，确诊时大多已属晚期，化学治疗的效果较差，不良反应往往难以耐受，而且还存在肿瘤耐药等问题，这已成为制约胃癌治疗的一个瓶颈，因此，寻找新的高效、低毒药物以及治疗靶点显得尤为重要。目前研究发现，中药具有提高患者免疫功能，诱导肿瘤细胞凋亡，直接杀伤肿瘤细胞和逆转多药耐药等多种机制[12]。异欧前胡素具有多种药理学活性，尤其对多种肿瘤细胞系都具有明显的凋亡诱导效果。有研究从杭白芷的抗肿瘤活性部位中分离出了异欧前胡素，并发现异欧前胡素与其他组分相比较，具有更强的抗肿瘤作用。另有研究发现，杭白芷中的异欧前胡素能够降低结肠癌HT-29细胞系中p53、Bcl-2及Bax基因表达，且能够诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡[13-14]。在体外实验中发现，异欧前胡素对人乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231，人肺癌细胞株A549，人卵巢癌细胞株SK-OV-3，人皮肤癌细胞株SK-MEL-2，人中枢神经系统肿瘤细胞株XF498及人结肠癌细胞株HCT-15细胞均具有不同程度的抑制作用[15-16]。但目前关于异欧前胡素对人胃癌BGC-823细胞的凋亡诱导作用尚未见报道。

本研究通过形态学观察与定量分析相结合的方法，对异欧前胡素在人胃癌BGC-823细胞中的凋亡诱导作用进行研究，结果发现异欧前胡素对BGC-823细胞的存活具有明显的抑制作用，且增殖存活率与异欧前胡素呈剂量-时间依赖性。本研究结果还提示，异欧前胡素可以明显诱导BGC-823细胞发生凋亡，且在一定范围内随着异欧前胡素浓度的提高，凋亡率也随之升高。另外，本研究建立了裸鼠荷人胃癌BGC-823细胞的动物模型，发现异欧前胡素在裸鼠体内可以有效抑制移植瘤的增殖和生长。

综上所述，虽然本研究证实了异欧前胡素能够有效抑制人胃癌BGC-823细胞的增殖并诱导其凋亡，抑制胃癌细胞移植瘤的生长，但对于其具体的调控机制仍有待进一步研究。

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(本文编辑：周骏)

Effect of isoimperatorin on inducing apoptosis and proliferation inhibition of gastric cancer cells BGC-823

WANGTingxiang.TheSecondClinicalMedicalCollege,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou(310005),China;LOUGuoqiang,SHIJunping.

DepartmentofGastroenterology,theSecondPeople′sHospital,Hangzhou(310005),China

ObjectiveThis paper intends to explore the apoptosis and proliferation inhibition of isoimperatorin in human gastric cancer cells BGC-823. MethodsHuman gastric cancer cells were trainedinvitro, and taking the Dutch gastric cancer BGC-823 and nude mice model as the observation object, the effects of isoimperatorin on human gastric cancer BGC-823 cell proliferation, and survival rate and the induction of apoptosis were determined by using the MTT method and Annexin V-FITC/PI staining observation, and by observation of the nude mice tumor experiment of BGC-823 cell proliferation growth. ResultsThe survival rate of human gastric cancer cell proliferation cell line BGC-823 decreases with the increase of the concentration of isoimperatorin or the increase of the processing time, and there exists a dose-time dependence between the proliferation of survival and isoimperatorin. Isoimperatorin could significantly induce BGC-823 cells apoptosis, and within a certain range with the increase of the concentration of isoimperatorin, the apoptosis rate also would increase. Effective dose of isoimperatorin tumors within tumor volume injection could narrow nude mice and increase the tumor inhibition rate. The difference was statistically significant compared with the control group (P<0.05). ConclusionsIsoimperatorin can effectively inhibite cell proliferation of human gastric cancer BGC-823 and induce its apoptosis, inhibiting gastric cancer cell transplantation tumor growth. However, the specific regulatory mechanism of isoimperatorin requires further research.

Isoimperatorin; Gastric cancer; Proliferation; Apoptosis

浙江省中医药科技计划(2013ZA014)

310005杭州，浙江中医药大学第二临床医学院(王廷祥)；310005杭州市第二人民医院消化科(娄国强，施军平)

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.04.015

2016-03-25)