mTOR信号通路与胃癌的相关性研究

马志恒　蒋海存　陈建新　郝　鑫　李　萍　贾超丽　董　冬　张　刚



·临床研究·

mTOR信号通路与胃癌的相关性研究

马志恒蒋海存陈建新郝鑫李萍贾超丽董冬张刚

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，其自酵母中分离出来，在P13K/AKT/mTOR信号通路中是蛋白激酶B(Akt)的下游底物。mTOR是一种含有2 549个氨基酸残基的蛋白质分子，生理状态下，该蛋白在各种刺激因子的作用下发挥调控细胞周期、细胞生长增殖等作用，因此mTOR在多种肿瘤组织中表达异常受到关注，也是肿瘤治疗的靶点之一。p-mTOR是磷酸化的mTOR，是mTOR的活化形式。本研究采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western-blot)技术来检测胃癌及正常胃黏膜组织中p-mTOR mRNA及蛋白的表达情况，为胃癌的临床诊断和治疗提供帮助。

1　材料和方法

1.1材料

收集河北大学附属医院2011年1月至2015年1月期间手术切除的新鲜胃癌标本50例，癌旁正常胃黏膜组织50例(距肿瘤边缘>5 cm)，术前均未行放射治疗及化学治疗，术后病理学检查均为胃腺癌。50例胃癌标本中，男31例，女19例；年龄42～82岁，平均年龄(53±4.51)岁，年龄≤50岁27例，年龄>50岁23例；高分化10例，中低分化40例；有淋巴结转移35例，无淋巴结转移15例；浸润胃全层37例，未累及胃全层13例。新鲜标本-80℃低温冰箱保存备用。

1.2主要试剂

兔抗人p-mTOR单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，PCR引物合成于大连Takara公司，RT-PCR试剂盒购自Takara公司。β-actin一抗为鼠抗人单克隆抗体，购自美国Invitrogen公司。

1.3RT-PCR方法检测p-mTOR mRNA的表达

液氮中取出少量胃组织标本，用眼科剪剪碎，用TRIzol、氯仿和异丙醇提取总RNA，分析其完整性、纯度和浓度。逆转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)，逆转录反应条件为：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。逆转录反应体系10 μL。6 μL的DNA Ladder及20 μL扩增产物进行4%琼脂糖凝胶电泳(120 V，45 min)，相应位点出现单一电泳条带为阳性表达。采用ZF型紫外透射反射分析仪摄像，以β-actin做内参照，采用Quantity one4.62软件统计各条带的积分光密度值，以积分光密度值比值来分析各组之间的差异。p-mTOR上游引物为5′-CGCTGTCATCCCTTTATCG-3′，下游引物为5′-ATGCTCAAACACCTCCACC-3′，β-actin上游引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.4Western-blot方法检测p-mTOR蛋白的表达

液氮中取出少量胃组织标本，用眼科剪剪碎，提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度，浓缩胶5%，分离胶12%，加样，每孔上样量为20 μg，电泳，转膜，在含5%脱脂奶粉封闭液中封闭；加入一抗兔抗人p-mTOR单克隆抗体和小鼠抗人β-actin单克隆抗体，PBS洗膜3次，每次15 min；加二抗于室温孵育2 h后曝光，观察结果。p-mTOR蛋白的相对表达量用p-mTOR/β-actin表示。

1.5统计学分析

2　结果

2.1p-mTOR mRNA及蛋白在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达

p-mTOR mRNA扩增片段大小为190 bp，内参照β-actin扩增片段大小为250 bp。RT-PCR检测胃癌及正常胃黏膜组织中p-mTOR mRNA及蛋白的表达水平。50例胃癌标本中，p-mTOR mRNA的相对定量值为(0.626±0.041)，显著高于正常胃黏膜组织中p-mTOR mRNA的表达(0.318±0.091)。Western-blot方法的检测结果显示，50例胃癌标本中，p-mTOR蛋白的相对定量值为(0.543±0.052)，正常胃黏膜组织中的相对表达量为(0.295±0.021)，两组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1、图2。

2.2p-mTOR mRNA及蛋白表达与胃癌临床病理学特征的关系

Western-blot检测结果显示，p-mTOR蛋白的表达与患者性别、年龄、淋巴结转移及浸润深度无关，与肿瘤分化程度相关(P<0.05)，肿瘤分化程度的越低则p-mTOR蛋白的表达越高。RT-PCR检测结果显示，p-mTOR mRNA的表达与患者性别、年龄、淋巴结转移及浸润深度无关，与肿瘤分化程度相关(P<0.05)。两种方法的结果一致。见表2。

表1　p-mTOR mRNA及蛋白在胃癌及正常胃黏膜中的表达

图 1　p-mTOR mRNA在胃癌及正常胃黏膜中的表达

图 2　p-mTOR蛋白在胃癌及正常胃黏膜中的表达

临床特征np-mTOR蛋白表达量tPp-mTORmRNA表达量tP年龄/岁≤50>5027230.583±0.0280.529±0.0333.6310.8200.641±0.0250.618±0.0271.5300.363性别男女31190.552±0.0540.539±0.0811.8700.1800641±0.0280.620±0.0100.2310.418分化程度高中/低10400.243±0.0230.927±0.0373.4810.0200.491±0.0510.793±0.0633.8410.049淋巴结转移无有15350.518±0.0220.593±0.0481.5310.0900.585±0.0200.695±0.0173.6130.070浸润深度 浸润全层 未达全层37130.601±0.0200.498±0.0273.3210.0600.702±0.0260.579±0.0762.1600.059

2.3p-mTOR mRNA及蛋白表达的相关性。

Pearson直线相关分析显示，p-mTOR mRNA与蛋白在胃癌组织中的表达呈正相关(r=0.518，P=0.000)。

3　讨论

信号转导通路异常是公认的肿瘤病因之一，因此成为医学研究的热点。mTOR为多条信号通路的重要的下游分子，因其在不同物种(从酵母类到各种高级哺乳动物)中固定存在，推断其有一定的生理作用。正常生理状态下，mTOR调节正常细胞的分裂增殖，当正常细胞异常增生甚至发生癌变时，mTOR通过活化过度表达而发挥作用，主要表现为参与癌细胞的代谢、凋亡、生长、增殖、分化等。mTOR参与的信号通路主要有两条：PI3K/Akt/mTOR和LKB1/AMPK/mTOR信号通路[1]。PI3K/Akt/mTOR通路在细胞增殖及肿瘤血管形成中发挥重要的作用，在肿瘤的病因学与预后因素中的研究较多，其在肿瘤形成过程中的作用包括促癌基因受体的活化、PI3K基因的突变或扩增、抑癌基因PTEN的表达减少、Akt基因的突变或扩增等。另一条是LKB1/AMPK/mTOR信号通路，抑癌基因LKB1通过磷酸化磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)从而激活AMPK，进而实现对mTOR的负性调控[2-4]。

mTOR与肿瘤发生的关系在不同组织学类型中均有研究。韩丽红等[5]采用酶联免疫吸附实验检测消化道肿瘤及健康体检者血清中mTOR的含量，结果显示消化道肿瘤患者血清中mTOR的含量显著高于健康体检者，提示mTOR可能可以作为消化道肿瘤诊断和预测预后的新指标。刘桠菲等[6]采用半定量免疫组化法检测35例低级别脑胶质瘤、36例高级别脑胶质瘤及10例正常脑组织中mTOR的表达，结果显示与正常脑组织相比，人脑胶质瘤中的mTOR表达均显著增加；在高级别胶质瘤中，两者的阳性表达率显著高于低级别组；认为mTOR在脑胶质瘤中的表达明显增加，其可能在神经胶质瘤的发生发展中具有重要的作用。其他肿瘤如垂体瘤[7]、胃癌[8]、宫颈癌[9]和肺癌[10]等也均见有mTOR过表达的报道。本研究结果显示，50例胃癌标本中p-mTOR mRNA及蛋白的相对定量值显著高于正常胃黏膜组织(P<0.05)，与上述研究结果一致。RT-PCR和Western-blot检测结果均显示，p-mTOR mRNA和蛋白的表达与患者性别、年龄、淋巴结转移及浸润深度无关，而与肿瘤分化程度相关(P<0.05)，随着胃癌组织恶性程度的增加，p-mTOR的表达呈升高趋势，这也充分说明了该基因与胃癌发生存在密切的关系。

PI3K/Akt/mTOR信号转导通路在多种肿瘤组织(包括胃癌)中发挥着重要的作用，胃癌的发展是多基因、多种信号通路共同作用的过程，本研究为胃癌的研究打下了良好的基础，也为胃癌的分子学治疗提供了一定的依据。

1 陆建国. mTOR信号通路与肿瘤研究进展[J]. 现代医药卫生. 2015, 31: 199-202.

2 Pisick E, Jagadeesh S, Salgia R. Receptor tyrosine kinases and inhibitors in lung cancer[J]. Sci World J, 2004, 6: 589-604.

3 Shaw RJ, Cantley LC. Ras, PI(3)K and mTOR signalling controls tumour cell growth[J]. Nature, 2006, 441: 424-430.

4 Massion PP, Taflan PM, Shyr Y, et al. Early involvement of the phos-phatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in lung cancer progression[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2004, 170: 1088-1094.

5 韩丽红, 闫斌, 秦艳晶. 血清mTOR检测对消化系统恶性肿瘤患者的临床意义[J]. 中国医学装备, 2014, 17: 17-18.

6 刘桠菲, 刘献志, 翟广. mTOR和Survivin在人脑神经胶质瘤中的表达及临床意义[J]. 河南医学研究, 2015, 24 : 4-6.

7 Monsalves E, Jurasczhka K, Tateno T, et al. The PI3K/AKT/mTOR pathway in the pathophysiology and treatment of pituitary adenomas[J]. Endocr Relat Cancer, 2014, 21: R331-R344.

8 Li M, Sun H, Song L, et al. Immunohistochemical expression of mTOR negatively correlates with PTEN expression in gastric carcinoma[J]. Oncol Lett ,2012, 4: 1213-1218.

9 夏百荣, 孟凡玲, 卢北燕. mTOR, eIF4E, 4E-BP1在宫颈癌组织中的表达及临床意义[J]. 实用肿瘤学杂志, 2011, 25: 301-305.

10 王亮, 许绍发, 岳文涛, 等. mTOR和PTEN在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义[J]. 中国肺癌杂志, 2010, 13: 717-721.

(本文编辑：林磊)

河北省政府资助临床医学优秀人才培养和基础课题研究计划项目(361007)

071500河北保定，高阳县医院外科(马志恒，蒋海存，陈建新)；071000河北保定，河北大学附属医院胃肠外科(李萍，贾超丽，董冬，张刚，郝鑫)

张刚，Email: zhanggang268@sina.com

10.3969/j.issn.1673-534X.2016.04.019

2016-01-11)