抑制CXCR4基因调控Wnt/β-catenin通路在卵巢癌转移中的作用

王　佳，王泽华

(1. 西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西西安　710061；2. 华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，湖北武汉　430022)



◇基础研究◇

抑制CXCR4基因调控Wnt/β-catenin通路在卵巢癌转移中的作用

王佳1，王泽华2

(1. 西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西西安710061；2. 华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，湖北武汉430022)

目的研究趋化因子受体4(chemokinereceptor4,CXCR4)在卵巢癌转移中的作用及其机制。方法采用Real-timePCR和Westernblot法检测正常卵巢组织、卵巢癌组织和卵巢癌细胞株(CAOV3)CXCR4mRNA和蛋白的表达以及CXCR4shRNA转染后卵巢癌CAOV3中CXCR4mRNA和蛋白的表达；MTT法检测CXCR4shRNA对卵巢癌细胞增殖的影响；通过Transwell侵袭实验检测CXCR4基因沉默对卵巢癌细胞侵袭性的作用；Real-timePCR法检测CXCR4shRNA转染后Wnt/β-catenin通路相关基因和EMT相关基因的mRNA表达。结果CXCR4在卵巢癌组织和CAOV3细胞中的表达明显高于正常卵巢组织；转染CXCR4shRNA可有效抑制CAOV3细胞中CXCR4mRNA和蛋白表达；CXCR4基因沉默可有效抑制细胞增殖、降低细胞侵袭性；同时明显抑制Wnt/β-catenin通路相关基因CTNNBI、C-MYC、MMP-9和CD44以及EMT相关基因SLUG和Vimentin的mRNA表达。结论CXCR4通过调控Wnt/β-catenin通路影响卵巢癌的转移。

卵巢癌；趋化因子受体(CXCR4)；Wnt/β-catenin；RNA干扰

卵巢癌在妇科肿瘤中死亡率位居第一，由于起病隐袭，大部分卵巢癌病人确诊时已发生转移，全世界发生转移的卵巢癌患者5年生存率不足30%[1]。细胞转移是一个多因素过程，其中趋化因子及其受体在肿瘤转移和侵袭中具有重要作用。目前已发现50多个趋化因子及20多个趋化因子受体[2]，其中只有趋化因子受体4(chemokinereceptor4,CXCR4)在卵巢癌细胞上表达。有研究表明CXCR4的表达与卵巢癌的转移相关，但其机制尚不明确。Wnt/β-catenin通路在细胞增殖、迁移等方面起重要作用[3]，该通路主要组份β-catenin在异常情况下胞质大量蓄积并入核与核内T细胞转录因子(TCF)结合，增加下游靶基因的转录合成。异常的β-catenin能够激活上皮间充质细胞转化(EMT)过程，影响细胞转移[4]。在胚胎发育研究中发现，CXCR4通过调控Wnt/β-catenin影响多器官发育。本研究探讨CXCR4是否通过Wnt/β-catenin通路影响卵巢癌的转移。

1　材料与方法

1.1细胞和试剂人卵巢癌细胞株CAOV3来自ATCC。主要试剂包括CXCR4鼠抗人单克隆抗体(Abcam公司)，DMEM培养基(GIBCO公司)，胎牛血清(GIBCO公司)，Lipofectamine2000(Invitrogen公司)，逆转录酶试剂盒和SYBRGreenReal-timePCR反应液(Toyobo公司)，鼠抗人CXCR4单克隆抗体(Abcam公司)，鼠抗人β-actin多克隆抗体(武汉博士德公司)，HRP标记二抗(SantaCruz公司)，引物(上海英骏生物技术有限公司)。

1.2细胞培养人卵巢癌细胞株CAOV3常规培养在含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37 ℃，50mL/LCO2饱和湿度，待细胞长满瓶底时，2.5g/L胰蛋白酶消化传代。

1.3CXCR4shRNA的构建与转染shRNA表达载体由上海吉玛生物有限公司合成，针对CXCR4的shRNA(shCXCR4)序列为：5′-CACCGGATCAGCATCGACTCCTTCATTCAAGAGATGAAGGA-

GTCGATGCTGATCCTTTTTTG-3′；阴性对照(shNC)的序列为：5′-CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCG-

GAGAATTTTTTG-3′。严格按照LipofectamineTM2000试剂说明书进行转染。转染前1d用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基接种细胞于24孔板，1×105/孔。转染当天更换为500μL无血清培养基。分别于50μL无血清培养基中加入0.8μgshRNA和2μLLipofectamineTM2000，室温放置5min后混合，室温放置20min。将上述混合物加入24孔板中，轻轻混匀，培养6h后，将培养基换为500μL含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基，继续培养48h或72h。

1.4Real-timePCR检测mRNA表达Trizol法提取细胞总RNA,按逆转录试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA。在ABI7300荧光定量PCR仪上进行检测。反应条件为：95 ℃ 5min；94 ℃ 15s，60 ℃ 45s，72 ℃ 30s，40个循环。用2-△△Ct法[5]计算基因相对表达水平。实验重复3次。

1.5Westernblot检测CXCR4蛋白表达裂解提取细胞总蛋白，按BCA法进行蛋白定量。将细胞总蛋白煮沸5min使蛋白变性，SDS-PAGE电泳分离后，湿转到硝酸纤维素膜上，将膜置于50g/L脱脂奶粉中室温封闭1h，然后加入鼠抗人CXCR4单克隆抗体(1∶100)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10min，再与辣根酶标记的羊抗鼠二抗(1∶5 000)室温孵育1h，TBST洗膜后，以ECL显色，X线胶片暴光，洗片，用凝胶成像系统检测蛋白表达灰度值。实验重复3次。

1.6MTT法检测细胞增殖取对数生长期的细胞接种于96孔板，1×104/孔，培养24h后进行转染，分别于转染1、2、3、4、5d后加入5g/L的MTT溶液，20μL/孔，继续培养4h后，吸去上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，震荡10min后用酶标仪在490nm波长测定A值，绘制生长曲线。

1.7Transwell法检测细胞侵袭性Transwell小室中加入用无血清DMEM培养基稀释的Matrigel，37 ℃静置4～6h，待胶凝固，将各组细胞消化，用无血清DMEM培养基调整细胞浓度至2.5×105/mL，于上室加入细胞悬液400μL，Transwell小室的下室加入含100mL/L胎牛血清的DMEM培养基做趋化液，培养16～24h后，取出小室，用棉签小心擦除滤膜上室面的细胞，以无水乙醇固定粘附在下室面的细胞，HE染色。显微镜下随机计数5个视野的细胞数目，取平均值作为该次实验结果。实验重复3次。

1.8统计学处理实验数据用SPSS18.0统计软件进行统计分析，数据均用均数±标准差表示，两组以上数据间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，非正态分布数据组间差异分析采用非参数检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1CXCR4在卵巢癌的表达采用Real-timePCR法检测7个正常卵巢组织、49个卵巢癌组织以及卵巢癌细胞株A2780、SKOV3和CAOV3中CXCR4mRNA的表达。采用非参数检验发现，CXCR4mRNA在卵巢癌组织和卵巢癌细胞株中的表达明显高于正常卵巢组织(P<0.001)，在研究的3种细胞株中，CAOV3中CXCR4mRNA表达最高(图1A)。Westernblot结果也同样证明CAOV3细胞中CXCR4蛋白表达最高(图1B)。所以选择CAOV3作为本实验研究对象。

图1CXCR4在卵巢癌组织及细胞中的表达

Fig.1ExpressionofCXCR4inovariantissuespecimensandovariancancercells

A：Real-timePCR检测CXCR4mRNA在正常卵巢组织、卵巢癌组织及卵巢癌细胞株中的表达；B：Westernblot检测CXCR4蛋白在3种卵巢癌细胞株中的表达。β-actin为内参。与正常卵巢组织比较，***P<0.001。

2.2CXCR4shRNA抑制CAOV3细胞CXCR4表达分别于转染CXCR4shRNA后48、72h检测CAOV3细胞CXCR4的mRNA和蛋白表达。数据符合正态分布，采用独立样本t检验。结果显示：转染shCXCR4的细胞与阴性对照(shNC)组细胞相比，CXCR4的mRNA水平下降了91%(P=0.003)(图2A)，蛋白水平下降了46%(P=0.008)(图2B)，差异具有统计学意义。

2.3CXCR4基因沉默对CAOV3细胞增殖和侵袭性的影响分别于CXCR4shRNA转染CAOV3细胞后1、2、3、4、5d进行MTT检测。与shNC组比较，shCXCR4对CAOV3细胞的增殖有明显抑制作用，在第4天(P=0.037)和第5天(P=0.011)差异具有统计学意义(图3)。Transwell侵袭实验发现，shCXCR4组具有侵袭性的细胞数为(9.33±2.52)个，与shNC组(17.00±2.65)个相比差异具有统计学意义(P<0.05，图4)。

2.4CXCR4基因沉默对Wnt通路相关基因和侵袭相关基因表达的影响为了研究CXCR4与Wnt/β-catenin通路之间的关系，采用Real-timePCR法检测CXCR4shRNA转染后Wnt/β-catenin通路中β-catenin的编码基因CTNNB1，靶基因C-MYC、MMP-9和CD44的mRNA表达，同时检测EMT相关基因vimentin和SLUG的mRNA表达。数据符合正态分布，采用独立样本t检验。结果显示：与shNC组比较，shCXCR4可明显抑制Wnt/β-catenin通路相关基因和EMT相关基因的表达(P<0.05，图5)。

图2转染CXCR4shRNA后卵巢癌细胞CXCR4mRNA和蛋白的表达

Fig.2CXCR4expressionaftershRNAtransfectionA：Real-timePCR检测CXCR4基因的表达；B：Westernblot检测CXCR4蛋白的表达。β-actin为内参。与shNC组比较，**P<0.01。

图3CXCR4基因沉默对CAOV3细胞增殖的影响

Fig.3TheknockdownofCXCR4inhibitedtheproliferationabilityofCAOV3ovariancancercells

与相同时间点shNC比较，*P<0.05。

图4CXCR4基因沉默对CAOV3细胞侵袭性的影响

Fig.4TheknockdownofCXCR4inhibitedtheinvasiveabilityofCAOV3ovariancancercells

A：shNC；B：shCXCR4。与shNC组比较，*P<0.05。

图5CXCR4基因沉默对Wnt通路相关基因和EMT相关基因表达的影响

Fig.5InfluenceofCXCR4knockdownonWnttargetgenesandEMT-relatedgenes

与shNC比较，*P<0.05，**P<0.01。

3　讨　　论

预防或减缓细胞转移的治疗可以明显提高卵巢癌患者生存率。细胞转移是一个多因素调整的过程，CXCR4是趋化因子家族的重要成员之一，也是唯一在卵巢癌细胞表达的趋化因子受体。已有研究证明，正常的乳腺组织低表达CXCR4，而乳腺癌组织中CXCR4的表达明显增加[6]。CXCR4的表达与前列腺癌、肺癌、食道癌和黑素瘤等肿瘤的不良预后相关[7-10]。体外研究发现，CXCR4基因沉默可抑制乳腺癌的转移。研究运用RNA干扰来探讨CXCR4在卵巢癌转移中的作用及其机制。

我们首先检测了正常卵巢组织、卵巢癌组织及卵巢癌细胞株中CXCR4mRNA和蛋白的表达，发现卵巢癌组织和细胞株都高表达CXCR4,并且在研究的三种细胞株中，CAOV3的CXCR4表达最高。为研究CXCR4的作用，我们设计合成针对CXCR4的shRNA质粒载体，为了避免空载体对细胞的影响，同时合成无义序列的质粒作为阴性对照。实验结果表明shCXCR4可以有效地抑制CXCR4mRNA和蛋白的表达。由于肿瘤的发生是细胞无限增殖的结果，我们在CXCR4表达抑制的基础上检测了CAOV3细胞的生长。结果表明，CXCR4基因沉默可明显降低CAOV3细胞的增殖活性，与汤容[11]等的研究结果一致。为进一步研究CXCR4在卵巢癌转移中的作用，我们进行Transwell侵袭实验，结果表明转染shCXCR4的细胞侵袭性被明显抑制，验证了我们先前研究的SDF-1/CXCR4轴在卵巢癌侵袭性中起重要作用的结果[12]。

CXCR4影响细胞增殖和迁移的特异机制目前尚不明确。Wnt/β-catenin通路的活化在许多人类肿瘤中被发现[13]，而且其靶基因的激活可以通过影响细胞迁移、增殖和血管生成等促进肿瘤的发展[14]。我们检测了Wnt/β-catenin通路中的主要靶基因CTNNB1(编码β-catenin)、C-MYC、MMP-9和CD44在CXCR4基因沉默细胞中的表达，发现这些基因的表达明显降低。WANG[15]等研究证明阻断CXCR4可以抑制Wnt/β-catenin通路在胰腺癌中的活性。另外，由于Wnt/β-catenin通路参与了EMT过程，我们同时检测了EMT过程中主要基因SLUG和Vimentin表达，结果发现CXCR4基因沉默后SLUG和Vimentin基因表达明显下调，与ONOUE等[16]在口腔癌中的研究结果一致。

综上所述，CXCR4的表达与卵巢癌细胞增殖与侵袭性密切相关，CXCR4基因沉默可以通过抑制Wnt/β-catenin通路从而抑制卵巢癌的转移。本研究结果证明CXCR4在卵巢癌转移中起重要作用，CXCR4有可能成为卵巢癌患者基因治疗的有效靶点。

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(编辑邱芬)

BlockageofCXCR4affectsthemetastasisofovariancancerviaWnt/β-cateninsignalingpathway

WANGJia1,WANGZe-hua2

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061; 2.DepartmentofObstetricsandGynecology,UnionHospitalofTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China)

ObjectiveTodeterminetheroleandthepossiblemechanismsofchemokinereceptor4 (CXCR4)inthemetastasisofovariancancer.MethodsReal-timePCRandWesternblotwereusedtoanalyzetheexpressionofCXCR4innormalovariantissues,malignantepithelialovariantumorsandovariancancercelllinesandtheexpressionofCXCR4inCAOV3cellaftertransfectedwithshRNAagainstCXCR4.MTTassayandTranswellmigrationassaywereusedtodetecttheresultingalterationsincellproliferationandmigration.Last,wedetectedthemRNAexpressionofWnt/β-cateninrelatedgenesandEMT-relatedgenes.ResultsCXCR4washighlyexpressedinmalignantovariantumorsandovariancancercelllines.CXCR4expressionwasinhibitedbyshRNAagainstCXCR4.KnockdownofCXCR4couldobviouslyreducetheproliferationandinvasionofovariancancercells.Moreover,Wnttargetgenes(CTNNBI,C-MYC,MMP-9,andCD44)andmesenchymalmarkerssuchasVimentinandSLUGwerealsoinhibitedbyshRNAagainstCXCR4.ConclusionCXCR4playsacriticalroleinthemetastasisofhumanovariancancerthroughmodulatingtheWnt/β-cateninsignalingpathway.

ovariancancer;chemokinereceptor4 (CXCR4);Wnt/β-catenin;RNAinterference

2015-12-17

2016-05-25

王泽华.E-mail:zehuawang@163.net

R737.33

A

10.7652/jdyxb201605009

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1119.006.html(2016-08-03)