NANOG在肝细胞癌中的表达及意义

薛雨墨，姚博文，刘志奎，徐　蒙，涂康生，王军

(西安交通大学第一附属医院：1.肝胆外科，2.急诊科，陕西西安　710061)



◇基础研究◇

NANOG在肝细胞癌中的表达及意义

薛雨墨1，姚博文1，刘志奎1，徐蒙1，涂康生1，王军2

(西安交通大学第一附属医院：1.肝胆外科，2.急诊科，陕西西安710061)

目的探讨NANOG在肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)癌组织中的表达，并通过下调肝癌MHCC-97H细胞中NANOG的水平观察其对MHCC-97H细胞侵袭和迁移能力的影响。方法收集89例HCC组织及对应的癌旁组织，应用免疫组化检测NANOG蛋白在肝癌及对应癌旁组织中的表达，并分析其表达与肝癌临床病理特征的关系。采用小干扰RNA(siRNA)下调肝癌MHCC-97H细胞中NANOG水平，Transwell实验检测MHCC-97H细胞的侵袭及迁移能力。结果NANOG在肝癌组织中表达水平显著高于相应癌旁组织；肝癌组织中NANOG高表达与肿瘤大小、TNM分期、门静脉侵犯及Edmondson分级显著相关；NANOG高表达患者3年生存率明显低于低表达组；特异性siRNA下调NANOG水平后，明显抑制MHCC-97H细胞的侵袭和迁移。结论NANOG在肝癌组织中的表达上调并与肝癌恶性临床病理特征有关，下调NANOG明显抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。

NANOG；肝细胞癌；侵袭；迁移

肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是癌症原因致死的第3大肿瘤，起病隐匿，临床表现不典型、转移早、易复发，大多数患者在诊断时已为晚期，失去了手术切除的机会，预后极差[1-3]。目前，药物靶向治疗为中晚期肿瘤的治疗开辟了新的思路。因此，研究肝癌发生、发展的分子机制，确定有效的诊断标志物或作用靶点已成为当前研究热点[4]。NANOG是MITSUI和CHAMBERS几乎同时报道的在囊胚内细胞群、原始生殖细胞以及胚胎干细胞系表达的新的转录因子[5-6]。NANOG属ANTP类、NK家族基因，在人定位于12号染色体12p13.31，其主要作用于胚胎干细胞自我更新、维持细胞分化状态，促进细胞增殖[7-8]。研究发现，在精原细胞瘤、乳腺癌、宫颈癌、睾丸原位癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤组织中，NANOG处于高表达状态[9-12]。NANOG的过表达与肿瘤细胞干性、肿瘤的增殖、侵袭与迁移密切相关，通过抑制其表达或功能可抑制肿瘤的恶性表型。目前，NANOG在肝癌中的表达水平及其与肝癌的临床病理及预后的关系研究较少。本实验通过免疫组化检测NANOG在肝癌中的表达水平，并分析其与患者临床病理资料及预后的关系，通过siRNA技术检测NANOG的下调对HCC细胞侵袭和迁移能力的影响。

1　材料与方法

1.1研究对象收集并筛选2011年1月至2011年12月期间在西安交通大学第一医院肝胆外科手术治疗后经病理证实的肝细胞癌患者共计89例，其中男76例，女13例；年龄26～75岁，中位年龄53岁。所有入组患者均签署知情同意书。患者术前均未接受放疗、化疗等其他辅助治疗。患者术后平均随访时间为36个月。癌旁组织为距肿瘤边缘>2cm的肝组织，所有组织为术后获得的新鲜标本组织，组织获得后立即转移至液氮及40g/L多聚甲醛固定后常规石蜡包埋。

1.2细胞株及试剂人肝癌细胞株MHCC-97H细胞购自中国科学院上海生命研究所。DMEM细胞培养基、胰蛋白酶购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；兔抗人NANOG多克隆抗体购自Bioworld公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥公司；脂质体(Lipofectamine2000)购自Invitrogen公司；NANOGsiRNA及对照siRNA购自上海吉玛公司；Transwell小室购自Millipore公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所，ECL化学发光试剂盒购自Milipore公司。

1.3方法

1.3.1免疫组化法检测NANOG蛋白的表达组织标本经常规脱水、石蜡包埋，制作4μm切片。切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化后，96 ℃微波柠檬酸盐抗原热修复15min，30mL/LH2O2灭活内源性过氧化物酶10min；100mL/L山羊血清封闭；兔抗人NANOG抗体(1∶300)，4 ℃孵育过夜；洗涤后，加生物素标记的山羊抗兔二抗工作液(1∶1 000)，37 ℃孵育60min；洗涤后，加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(1∶500)37 ℃孵育30min，洗涤后，DAB显色，苏木素复染，逐级梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每张切片经2位病理医师，在高倍镜(×400)下随机选取5个视野，按以下标准单独阅片、评分：染色强度评分：0分：阴性；1分：弱阳性；2分：中度阳性；3分：强阳性。阳性细胞百分比评分：阳性细胞≤5%为0分、5%<1分≤25%、25%<2分≤50%、50%<3分≤75%、4分>75%。每视野评分=染色强度评分×阳性肿瘤细胞百分比评分，取平均分作为切片终评分。

1.3.2细胞培养与转染人肝癌细胞株MHCC-97H培养于含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，37 ℃、50mL/LCO2培养箱中常规培养。用2.5g/L胰酶消化传代。取对数生长期的细胞进行实验。待细胞汇合率达70%左右按照LipofectamineTM2000说明书以100nmol/LNANOGsiRNA及阴性对照组(controlsiRNA)加入6孔板中。用无双抗100mL/L血清的DMEM培养细胞48h后进行后续实验。

1.3.3Westernblot法检测NANOG蛋白表达利用RIPA(强)试剂盒提取转染后MHCC-97H细胞内总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(BCAkit)检测蛋白样品浓度。各组样品均加样40μg，SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。50g/L脱脂奶粉封闭1.5h，加50g/LBSA稀释的兔抗NANOG多克隆抗体(1∶500)及小鼠抗β-actin单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜；TBST(TBS，1mL/LTween-20)洗膜3次，6min/次；分别加HRP标记的抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)，室温孵育2h，ECL化学发光剂暗室显影。

1.3.4Transwell侵袭及迁移实验取转染48h后的MHCC-97H细胞，重悬细胞调整细胞数为1×106个/mL。50mg/LMatrigel胶1∶8稀释液包被Transwell小室(孔径8μm)底部(侵袭实验铺胶、迁移实验未铺胶)。取各组细胞悬液200μL加入Transwell小室，24孔板下室加入500μL100mL/L胎牛血清的完全培养基。每组重复3个样本。继续将24孔细胞培养板培养24h，取出Transwell小室，用PBS液淋洗，棉签擦去基质胶及微孔膜上层细胞，40g/L多聚甲醛固定，1g/L结晶紫染色，在倒置显微镜下计算移至微孔膜下层的细胞数，每个样本随机选取8个200倍视野求细胞计数的平均数。

2　结　　果

2.1NANOG在HCC及对应癌旁组织中的表达免疫组化检测HCC及对应癌旁组织中NANOG的表达，NANOG阳性染色主要定位于细胞核和细胞质。结果显示，NANOG在HCC组织中的阳性表达率为52.8%(47/89)，而在对应癌旁组织中的阳性表达率为13.5(12/89)(图1A、1B)；经免疫组化评分，NANOG在肝癌中的表达明显高于癌旁组织中的表达(P<0.05，图1C)。

图1NANOG在肝癌及对应癌旁组织中的表达

Fig.1TheexpressionofNANOGinHCCandmatchedadjacentpara-carcinomatissues(×400)

A：肝癌组织；B：癌旁组织；C：NANOG免疫组化评分。与癌旁组织比较，*P<0.05。

2.2NANOG表达与肝癌患者临床病理特征的关系对89例HCC病例的临床病理资料分析，以免疫组化结果分为NANOG阳性组(n=47)与NANOG阴性组(n=42)。结果发现，NANOG高表达与肿瘤大小(>5cm)、TNM分期(Ⅲ期和Ⅳ期)、门静脉侵犯及Edmondson分级相关(P<0.05，表1)。

表1NANOG的表达与肝癌临床病理特征的关系

Tab.1RelationbetweenNANOGandclinicopathologicfeaturesof89HCCpatients(n=89)

项目类别NANOG阳性组(n=47)阴性组(n=42)P性别男39370.495女85年龄<50岁19180.816≥50岁2824肿瘤直径<5cm33380.018*≥5cm144肿瘤数目1个40370.680≥2个75TNM分期Ⅰ+Ⅱ27350.008*Ⅲ+Ⅳ207门静脉侵犯无37400.023*有102AFP<400ng/mL31290.756≥400ng/mL1613HBV感染无630.599有4139EdmondsonⅠ+Ⅱ29350.023*Ⅲ+Ⅳ187

*P<0.05。

2.3NANOG的表达与患者生存率的关系结果显示，阳性表达NANOG的患者3年生存率明显低于阴性表达患者，差异具有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2Kaplan-Meier法分析NANOG表达水平与肝癌患者生存率的关系

Fig.2Kaplan-MeieroverallsurvivalratecurvesforHCCpatientsaccordingtothelevelofNANOGexpression

2.4MHCC-97H细胞中干扰NANOG表达人肝癌MHCC-97H细胞转染NANOGsiRNA或ControlsiRNA，Westernblot法检测发现NANOG蛋白表达显著降低(P<0.05，图3)。

2.5下调NANOG表达抑制MHCC-97H肝癌细胞的侵袭铺胶的Transwell侵袭实验显示，siRNA下调NANOG表达可明显抑制MHCC-97H细胞的侵袭能力(P<0.05，图4)。

2.6下调NANOG表达抑制MHCC-97H肝癌细胞的迁移为进一步研究NANOG对肝癌细胞迁移能力的影响，未铺胶的Transwell实验显示，下调NANOG表达能明显抑制MHCC-97H细胞的迁移能力(P<0.05，图5)。

图3NANOG靶向沉默对MHCC-97H细胞NANOG表达的抑制作用

Fig.3TheinhibitoryeffectofsiRNAtargetingforNANOGontheexpressionofNANOGinMHCC-97Hcell

A：Westernblot检测siRNA靶向沉默MHCC-97H细胞中NANOG的表达；B：半定量分析3次重复实验中siRNA沉默NANOG的表达。与对照组比较，*P<0.05。

3　讨　　论

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，因其早期浸润生长并发生远处转移致使大部分患者就诊时已失去根治性手术机会，严重影响患者预后[13]。因此，寻找新的有效的HCC分子标志物及治疗靶点，已成为提高我国HCC诊断和治疗水平的重要途径。

系列研究表明，NANOG作为胚胎干细胞的特异性基因，主要表达于胚胎和生殖细胞肿瘤中，但随着肿瘤干细胞研究的进展，在非生殖系统肿瘤中也发现NANOG的异常表达，且NANOG是干细胞维持其全能性和自我增殖的重要调控因子[14]。NANOG可通过与CDK6相互作用影响星形胶质细胞的增殖[15]；NANOG在胰腺癌中异常高表达，且可作为预测患者预后的指标；NANOG在胃癌中可促进胃癌的增殖、侵袭及转移，并且与化疗抵抗密切相关；在卵巢癌中，NANOG可以与CD34及透明质酸结合形成复合物，启动NANOG下游的干细胞基因，如Sox2、Rex1等的表达，并且与STAT3之间形成通路激活其下游的耐药基因如MDR1表达，共同促进肿瘤细胞

图4下调NANOG抑制MHCC-97H细胞侵袭

Fig.4DownregulationofNANOGinhibitedtheinvasionofMHCC-97H

A：ControlsiRNA组；B：NANOGsiRNA组；C：Transwell实验各组穿膜细胞数分析。与对照组比较，*P<0.05。

图5下调NANOG抑制MHCC-97H细胞迁移

Fig.5DownregulationofNANOGinhibitedthemigrationofMHCC-97H

A：ControlsiRNA组；B：NANOGsiRNA组；C：Transwell实验各组穿膜细胞数分析，与对照组比较，*P<0.05。

的增殖和多重耐药[16]。而本研究通过对89例HCC组织标本检测发现，在HCC组织中NANOG的表达水平显著高于对应癌旁组织，并且NANOG在肝癌中的表达多位于细胞核，且NANOG的过表达与肿瘤大小(≥5cm)、高TNM分期、门静脉侵犯及高Edmondson分级等HCC恶性临床病理特征密切相关。通过随访，发现高表达NANOG患者的3年生存率明显低于低表达，提示NANOG的高表达预示患者预后不良。这与LIU等研究结果基本一致。而进一步通过小RNA干扰技术沉默MHCC-97H细胞中NANOG表达，结果证实NANOG表达降低后，肝癌MHCC-97H细胞的侵袭和迁移能力明显下调。这提示NANOG在肝癌的侵袭及转移过程中发挥重要作用。有研究表明，NANOG可以与Smad1相互作用并干扰辅激活蛋白的募集，妨碍Smad转录复合物的激活，从而阻止细胞分化。NANOG可通过作用于AURK及LGL-2的表达影响NUMB的磷酸化，从而影响p53的降解。但NANOG在肝癌中的作用机制仍需进一步探明。

综上所述，NANOG在HCC组织中表达显著升高，并与HCC的恶性临床病理特征密切相关，且高表达NANOG预示患者预后不良。在体外下调NANOG的表达有抑制肝癌细胞侵袭及迁移的作用。因此，NANOG可能成为新的HCC分子标志物及生物治疗靶点。

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(编辑卓选鹏)

ExpressionandclinicalsignificanceofNANOGinhepatocellularcarcinoma

XUEYu-mo1,YAOBo-wen1,LIUZhi-kui1,XUMeng1,TUKang-sheng1,WANGJun2

(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery; 2.DepartmentofEmergencyMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

ObjectiveTodetecttheexpressionofNANOGintumortissueofhumanhepatocellularcarcinomaanddeterminetheeffectofNANOGoncellinvasionandmigrationinMHCC-97HcellsbyknockdownofNANOG.MethodsWecollected85pairsofHCCandpara-carcinomatissuesanddetectedtheexpressionofNANOGbyimmunohistochemicalstaining.ClinicopathologicalandprognosticsignificanceofNANOGwasevaluatedinthesepatients.TheexpressionofNANOGwasknockeddownbysiRNAinMHCC-97Hcells.TranswellassayswereperformedtotestHCCcellinvasionandmigrationin vitro.ResultsTheexpressionofNANOGinHCCtissueswassignificantlyhigherthanthatinpairedpara-carcinomatissues,anditwassignificantlyassociatedwithtumorsize,TNMstage,portalveininfiltrationandEdmondsondegree.PatientsinthehigherNANOGgrouphadapoorer3-yearsurvivalthanthoseinthelowergroup.WhentheexpressionofNANOGwasdownregulatedbyaspecificsiRNA,NANOGknockdownobviouslyinhibitedcellinvasionandmigrationinMHCC-97Hcells.ConclusionNANOGisoverexpressedinHCCtissueandiscorrelatedwiththemalignantclinicopathologicfeatures.NANOGknockdowninhibitscellinvasionandmigrationofHCCcells.

NANOG;hepatocellularcarcinoma;invasion;migration

2016-01-12

2016-04-07

国家自然科学基金资助项目(No.81402039)；陕西省自然科学基础研究计划(No.2013JM4049)

王军.E-mail: 1017449024@qq.com

R735.7

A

10.7652/jdyxb201605014

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81402039)andtheNaturalScienceFoundationResearchProjectofShaanxiProvince(No.2013JM4049)

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1402.018.html(2016-08-03)