肝硬化脾切除患者外周血T淋巴细胞亚群的变迁及其免疫功能变化

郭婷婷



·论著·

肝硬化脾切除患者外周血T淋巴细胞亚群的变迁及其免疫功能变化

郭婷婷

目的了解肝硬化患者行脾切除术后外周T淋巴细胞亚群的变迁，分析其免疫功能情况。方法采用流细胞术检测75例肝硬化患者脾脏切除前后外周血总T细胞及其各亚群细胞的绝对含量。结果与脾切除前相比较，脾切除后患者T淋巴细胞绝对含量显著降低(t=4.57，P<0.01)；CD3阳性T细胞、CD4阳性T细胞及CD8阳性T细胞百分含量显著降低，分别由切除前的(63.47±6.45)%、(33.08±3.05)%、(22.45±7.85)%降至(48.62±5.85)%，(26.28±3.87)%及(15.89±4.84)%，差异有统计学意义(t值分别为8.67、5.32、5.87，P均<0.01)；而CD4/CD8比值由(1.47±0.43)升至(1.69±0.53)，差异有统计学意义(t=2.58，P<0.05)。脾切除前白细胞分化抗原CD3<50% 6例；CD4<27% 15例，CD8<15% 11例；CD4/CD8<0.71 4例；脾切除后CD3<50% 28例，CD4<27% 38例，CD8<15% 24例，CD4/CD8<0.71占6.7%(5例)；与脾切除前相比较，脾切除后CD3阳性、CD4阳性及CD8阳性淋巴细胞亚群异常率显著升高(t值分别为3.59、6.44及4.89，P<0.01)。此外，与脾切除前相比，脾切除后其T淋巴细胞分泌的一系列细胞因子如IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α均显著低于脾切除前。结论肝硬化脾切除患者存在明显的T细胞免疫功能紊乱，各亚群胞数量显著降低，CD3阳性T细胞明显下降，CD4阳性T细胞相对于CD8阳性细胞的功能亢进，随着病情加重CD4阳性T细胞的免疫应答能力进一步减退。

肝硬化；脾切除；T细胞亚群；免疫功能

肝硬化是目前临床肝胆科最常见的疾病之一，是在酒精等损害因素作用下引起的肝细胞弥漫性变性或坏死，继而出现肝纤维组织增生和肝细胞结节形成[1-2]。损伤因素的长期存在而未经正规有效治疗最终导致肝小叶结构和正常血液循环途径被改变，导致患者后期出现一系列不同程度的门静脉高压、肝功能障碍及肝衰竭、脾功能亢进及脾衰竭[3-4]。脾脏属于人体的次级淋巴器官，当机体受到抗原刺激后，淋巴细胞会以脾脏作为场所进行免疫应答并产生免疫效应分子[5-6]。然而，肝硬化患者由于门静脉高压的形成，脾脏血液循环发生障碍，造成脾脏肿大和功能亢进，最终导致细胞免疫功能的紊乱[7-8]。目前临床上针对此类疾病已广泛开展脾切除术，并取得了较好的疗效，但其对免疫功能的影响研究尚未深入。本研究采用流式细胞术及ELISA对75例肝硬化脾切除患者外周血T淋巴细胞亚群及其细胞因子的分泌水平进行检测和分析，探讨其对机体免疫功能的影响，为患者病情评估及疗效监测提供一定理论依据。

资料和方法

一、研究对象

选取珠海市人民医院住院肝硬化并行脾切除术的75例患者，所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年)》中肝硬化的诊断标准，并排除HIV抗体或梅毒抗体检测阳性或曾行泼尼松等免疫抑制治疗的患者。75例患者中男42例，女33例，年龄36～86岁，平均年龄48岁。所有患者入院后均完善肝硬化相关检查，积极预防并治疗相关病因及诱因，完善术前准备，择期行贲门周围血管离断术。术后行护肝、抗感染治疗，并予以补液、抑酸等支持治疗。患者出院后随访5年，每半年到院复查1次，检测术后患者免疫功能变化并观察其临床症状改善状况。该研究获得医院医学伦理部门批准，所有患者及其家属均被告知研究方案并签署纸质版知情同意书。

二、方法

治疗前采集所有患者静脉血2～3 mL，先予以EDTA-K2混合抗凝，然后采用BD十一通道流式细胞仪及配套试剂行T细胞亚群的检测，分别测定T细胞亚群CD3+、CD4+及CD8+的含量并计算其所占百分比，具体检测及实验方案按文献[9-10]进行。

三、T淋巴细胞的培养

取上述患者外周血4 mL加入含2 mL Ficoll的离心管中，缓缓加入Ficoll上层，400×g离心20 min。取PBMC层，PBS洗涤后，用1640培养液重悬单核细胞，取样计数并调至至106个/mL加入10%胎牛血清，然后置于体积分数为0.05的CO2培养箱中进行培养。

四、ELISA检测(双抗夹心法)

上述细胞培养48 h后，离心取上清液50 μL加入取包被好的96孔板中，其中阴性对照组加入50 μL PBS，阳性对照组加入50 μL标准品，将其置于室温下振荡反应2 h，PBS洗三遍后加入50 μL一抗稀释液(1∶500)；PBS洗三次加入50 μL辣根过氧化物酶二抗，将其置于室温下振荡反应1 h；PBS洗三遍后在所有孔内加入显色剂A、显色剂B各50 μL，在微孔振荡器上震荡10 s，混匀，封盖后将反应板置37 ℃孵育30 min；在所有反应孔里加入50 μL终止液，振荡反应5 s，使之充分混匀，用酶标仪(波长450 nm)读数。

五、统计学方法

结　　果

一、脾切除前后外周血T淋巴细胞亚群变迁

与脾切除前相比较，脾切除后患者T淋巴细胞绝对含量显著降低(t=4.57，P<0.01)，其绝对含量由切除前的(1.46±0.38)×109/L降至(0.43±0.09)×109/L；CD3阳性T细胞百分含量亦明显降低，其百分含量由切除前的(63.47±6.45)%降至(48.62±5.85)%，差异有统计学意义(t=8.67，P<0.01)；CD4阳性T细胞百分含量由(33.08±3.05)%降至(26.28±3.87)%，与脾切除前相比，差异有统计学意义(t=5.32，P<0.01)；CD8阳性T细胞百分含量由(22.45±7.85)%降至(15.89±4.84)%，与脾切除前相比，差异有统计学意义(t=5.87，P<0.01)；而CD4/CD8比值由(1.47±0.43)升至(1.69±0.53)，差异有统计学意义(t=2.58，P<0.05)。

脾切除前白细胞分化抗原CD3阳性T细胞百分数<50% 6例；CD4阳性T细胞百分数<27% 15例，CD8阳性T细胞百分数<15% 11例；CD4/CD8<0.71 4例；脾切除后CD3阳性T细胞百分数<50% 28例，CD4阳性T细胞百分数<27% 38例，CD8阳性T细胞百分数<15% 24例，CD4/CD8<0.71占6.7%(5例)；与脾切除前相比较，脾切除后CD3阳性、CD4阳性及CD8阳性T淋巴细胞亚群异常率均显著升高，差异有统计学意义(t值分别为3.59、6.44和4.89，P<0.01)。

二、细胞因子的分泌水平

脾切除前和脾切除后T淋巴细胞分泌的一系列细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α分别为1.00±0.13、1.00±0.16、1.00±0.21、1.00±0.15和0.56±0.14、0.63±0.09、0.71±0.08、0.48±0.14，脾切除后显著低于脾切除前的细胞因子分泌水平，差异有统计学意义(t值分别为4.32、3.85、5.47及4.77，P<0.01)。

三、脾切除后相关并发症

2例脾切除4年左右表现为CD3明显低下(18%～35%)，多次复查淋巴细胞亚群各指标无明显变化。脾切除后1年腹腔严重感染致死1例；脾切除5年内伴肺部重度感染致死3例；外伤后脾切除4年合并肺结核2例；切脾除后第3年、5年、6年发生肝癌各1例；脾切除后第4年前列腺癌和宫颈癌各1例。

讨　　论

抗原入侵体内或体内原有抗原经血液循环刺激机体T淋巴细胞产生细胞免疫，在这过程中，T细胞的活化即效应T细胞的产生均在脾脏进行[11-12]。脾脏作为机体最大的外周免疫器官，其对机体正常免疫功能的维持是十分重要的。行脾切除术后的慢性肝硬化门静脉高压患者会发生机体免疫系统紊乱，恶性肿瘤及严重感染。研究发现，CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群在维持血液正常免疫细胞循环功能中起到关键作用，肝硬化患者CD3阳性和CD4阳性细胞的表达水平与其总生存期呈正相关[13-14]。本研究表明，肝硬化脾切除患者外周血总T细胞及各亚群T细胞的百分含量和绝对含量均显著降低，淋巴细胞亚群异常率显著上升。慢性肝硬化患者行脾切除术后免疫功能的紊乱原因多重，第一，可能与术后T细胞生成受到抑制有关；第二，原有T细胞总量及其各亚群数量减少，T细胞免疫功能整体下降；第三，CD4阳性T细胞所占百分比升高，CD4/CD8比值显著升高，从而导致CD4阳性T细胞功能亢进。

T细胞亚群中CD4阳性T起中心调节作用，而CD8阳性T细胞则发挥抑制性T细胞和效应T细胞作用，两者的数量减少会大大削弱机体保护自我排除异己的免疫应答反应[15]，因此为减少脾切除术后CD3、CD4、NK细胞数量下降造成的免疫功能低下，对于肝硬化脾切除患者在给予相应治疗的同时应进行相应的免疫功能的干预，也能减少各种感染与肿瘤的发生。T细胞分泌的一系列细胞因子如IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α，不仅可正向调节免疫效应细胞杀伤活性，促进T细胞的增殖，通过正反馈调节进一步促进相关细胞因子的分泌，提高机体免疫力[11,13]；此外，细胞因子还可直接参与肿瘤细胞杀伤及抗感染机体免疫过程，在一定程度上反映了T细胞的免疫功能状态[16]。本研究发现，肝硬化脾切除患者不仅伴有外周血总T细胞及各亚群T细胞的百分含量和绝对含量的异常，其T淋巴细胞分泌的一系列细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α均显著低于脾切除前。因此，定期检测外周血总T细胞及各亚群T细胞的百分含量和绝对含量及其免疫功能状态，有助于及时掌握脾切除患者T细胞的免疫功能，对于病情判断、疗效监测及预后评估等均具有积极意义。

[1]Zhan XL, Ji Y, Wang YD. Laparoscopic splenectomy for hypersplenism secondary to liver cirrhosis and portal hypertension. World J Gastroenterol, 2014, 20: 5794-5800.

[2]Zhou J, Wu Z, Pankaj P, Peng B. Long-term postoperative outcomes of hypersplenism: laparoscopic versus open splenectomy secondary to liver cirrhosis. Surg Endosc, 2012, 26: 3391-3400.

[3]Cai Y, Liu Z, Liu X. Laparoscopic versus open splenectomy for portal hypertension: A systematic review of comparative studies. Surg Innov, 2014, 21: 442-447.

[4]Ikegami T, Yoshizumi T, Soejima Y, et al. Application of splenectomy to decompress portal pressure in left lobe living donor liver transplantation. Fukuoka Igaku Zasshi, 2013, 104: 282-289.

[5]Menasherian-Yaccobe L, Jaqua NT, Kenny P. Successful treatment of bleeding gastric varices with splenectomy in a patient with splenic, portal, and mesenteric thromboses. Case Rep Surg, 2013, 20: 273-280.

[6]Jiang GQ, Bai D, Chen P, et al. Modified laparoscopic splenectomy and azygoportal disconnection combined with cell salvage is feasible and might reduce the need for blood transfusion. World J Gastroenterol, 2014, 20: 420-426.

[7]Chen D, Luo X, Xie H, et al. Characteristics of IL-17 induction by Schistosoma japonicum infection in C57BL/6 mouse liver. Immunology, 2013, 139: 523-532.

[8]Matsuda T1, Iwasaki T, Mitsutsuji M, et al. Surgical outcomes of intracorporeal circular-stapled esophagojejunostomy using modified over-and-over suture technique in laparoscopic total gastrectomy. Surg Endosc, 2015, 29: 3386-3391.[9]Fan Y, Wu SD, Kong J, et al. Single-incision laparoscopic splenectomy with conventional instruments: preliminary experience in consecutive patients and comparison to standard multiple-incision laparoscopic splenectomy. J Laparoendosc Adv Surg Tech A, 2014, 24: 799-803.

[10]Kawanaka H, Akahoshi T, Itoh S,et al. Optimizing risk stratification in portal vein thrombosis after splenectomy and its primary prophylaxis with antithrombin III concentrates and danaparoid sodium in liver cirrhosis with portal hypertension. J Am Coll Surg, 2014, 219: 865-874.

[11]Kakisaka T1, Kamiyama T, Yokoo H, et al. Hand-assisted laparoscopic splenectomy for sclerosing angiomatoid nodular transformation of the spleen complicated by chronic disseminated intravascular coagulation: a case report. Asian J Endosc Surg, 2014, 7: 275-278.

[12]Moyana TN, Kendal WS, Chatterjee A, et al. Role of fine-needle aspiration in the surgical management of pancreatic neuroendocrine tumors: utility and limitations in light of the new World Health Organization classification. Arch Pathol Lab Med, 2014, 138: 896-902.

[13]Shi R, Zhang YM, Zhu ZJ, et al. Synchronous splenectomy and hepatectomy in patients with hepatocellular carcinoma, hypersplenism and liver cirrhosis. Hepatogastroenterology, 2014, 61: 1363-1367.

[14]Li C, Zhao H, Zhao J, et al. Prognosis of patients with hepatocellular carcinoma and hypersplenism after surgery: a single-center experience from the People's Republic of China. Onco Targets Ther, 2014, 7: 957-964.

[15]Zhe C, Jian-wei L, Jian C, et al. Laparoscopic versus open splenectomy and esophagogastric devascularization for bleeding varices or severe hypersplenism: a comparative study. J Gastrointest Surg, 2013,17: 654-659.

[16]Litvak DA, Malad S, Wascher RA, et al. Laparoscopic Splenectomy in Colorectal Cancer Patients with Chemotherapy-Associated Thrombocytopenia due to Hypersplenism. Case Rep Oncol, 2012, 5: 601-607.

(本文编辑：茹素娟)

Alteration of T-cell subsets in peripheral blood and immunologic function in liver cirrhosis patients with splenectomy

GuoTing-ting.

DepartmentofGastroenterology,ZhuhaiPeople'sHospital,Guangdong519000,China

ObjectiveTo investigate the alteration of peripheral blood T lymphocyte subsets and varied immune function in liver cirrhosis patients after splenectomy. MethodsThe absolute quantity of peripheral blood T lymphocyte subsets was detected using flow cytometry in 75 patients with liver cirrhosis before and after splenectomy. ResultsCompared with the prior to splenectomy, obviously decrease in absolute value of T cell was received in patients after splenectomy. The percentages of CD3+, CD4+ and CD8+ T cells were decreased from (63.47±6.45)%, (33.08±3.05)%, (22.45±7.85)% to (48.62±5.85)%, (26.28±3.87)%, (15.89±4.84)% respectively. However, CD4+/CD8+ ratio rose dramatically from (1.47±0.43) to (1.69±0.53) (t=P<0.05). The percentage of patients, which the frequencies of CD3+, CD4+ and CD8+ T cells were less than 50%, 27%, and 15% respectively, was increased from 8%, 20% and 14.7% to 37.3%, 50.7% and 32%, respectively. Additionaly, the percentage of patients with CD4/CD8<0.71 increased from 5.3% to 6.7%. Compared to before splenectomy, abnormal percentage of lymphocyte subsets after splenectomy, including CD3+、CD4+ and CD8+, was increased significantly (t=3.59, 6.44 and 4.89 respectively, allP<0.01), meanwhile the levels of cytokines secreted by T cells after splenectomy, including IL-2, IL-4, IFN-γ and TNF-a, were decreased significantly. ConclusionThere might be immune disorders in liver cirrhosis patients after splenectomy, such as apparent reduction in quantity of T lymphocyte subsets and hyperfunction of CD4+ T cell compared to CD8+ T cell. As the disease condition aggravates, the immune response ability of CD4+ T cell could be further weaken. Patients after splenectomy showing significant abnormality of lymphocyte subsets should be alert to the occurrence of tumor or infection.

Liver cirrhosis; Splenectomy; T-cell subsets; Immune function

519000广东珠海市人民医院消化科

2016-04-22)