固体型微生物肥料中有效活菌洗脱条件的优化

安琦，徐丹丹，冯炜健，殷博

固体型微生物肥料中有效活菌洗脱条件的优化

安琦1，2，徐丹丹3，冯炜健3，殷博1，2

（1.黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨150010；2.黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨150010；3.哈尔滨学院，哈尔滨150000）

为减弱固体型微生物肥料中细菌与载体的吸附作用，提高菌体的洗脱效率，以巨大芽孢杆菌为供试菌，褐煤为载体，研究不同温度、洗脱时间、pH、离子强度对菌体洗脱效率的影响，优化洗脱条件。结果显示：巨大芽孢杆菌的最佳洗脱条件为转速220 rpm、pH 7.6、离子浓度20 mM。

固体型微生物肥料；洗脱；优化

与其他剂型微生物肥料相比，固体型微生物肥料具有易储存和运输、施用方法简单及节约劳动成本等优点，受到农业生产者的青睐。有效活菌的数量是评价微生物肥料质量的关键因素。目前，测定微生物肥料中有效活菌数的方法依然采用平板计数法。但在实际工作中，对固体样品的检测一直存在菌体洗脱率效低的问题，不能准确反映固体样品中真实有效活菌数量。由于微生物菌体与载体之间的吸附作用，样品中的菌体在洗脱阶段未能被完全洗脱。因此，打破微生物与载体间的吸附作用，提高菌体洗脱率是目前急需解决的问题［1，2］。

本研究以微环境下颗粒间吸附作用原理为基础理论，重点研究代表性微生物菌体与生物有机肥主要载体之间的吸附作用及打破这种吸附的技术方法，提高菌体洗脱率，为固体型微生物肥料的广泛应用奠定了实验基础。

1 材料

1.1 实验菌种

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），黑龙江省科学院微生物研究所保存。

1.2 载体

草炭来自鸡西，有机质约50%，腐殖酸含量36.1%。褐煤来自鸡西，腐殖酸含量43.5%。鸡粪来自正大养鸡场，已腐熟。

1.3 培养基及缓冲液

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，1 000mLH2O，pH7.0。

磷酸盐缓冲液（pH5.8）：0.2 mol/L NaH2PO48 mL，0.3 mol/L NaH2PO492 mL。

磷酸盐缓冲液（pH6.4）：0.2 mol/L NaH2PO426.5 mL，0.3 mol/LNaH2PO473.5 mL。

磷酸盐缓冲液（pH7.2）：0.2 mol/L NaH2PO472 mL，0.3 mol/LNaH2PO428 mL。

磷酸盐缓冲液（pH7.6）：0.2 mol/LNaH2PO487 mL，0.3 mol/LNaH2PO413 mL。

磷酸盐缓冲液（pH8.0）：0.2mol/L NaH2PO494.7mL，0.3 mol/LNaH2PO45.3mL。

2 方法

2.1 菌液的制备

活化Bacillus megaterium的保藏菌株，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基100mL，30℃、120r/min培养48h后保存备用。

2.2 载体的处理

将草炭、褐煤和鸡粪3种载体的pH调至7.0，高压121℃蒸汽灭菌lh，检查无菌后备用。

2.3 吸附试验

Bacillus megaterium的接种菌数为3.4×108cfu/g，均匀混合到经高压蒸汽灭菌的草炭、褐煤和鸡粪3种载体中，用无菌水调水分30%～35%，密封室温放置备用。

2.4 菌体洗脱单因素试验

样品中有效活菌数的测定方法采用稀释平板法，具体操作参照国家标准GB 20287-2006。称取固体样品10g，加入带玻璃珠的盛有100 mL无菌水的三角瓶中，通常静置20min，180rpm震荡30min后，测定3种固体肥料样品的有效活菌数。选取5个影响菌体洗脱效果的主要因素，包括温度、洗脱时间、洗脱液pH值、转速、离子浓度进行单因素试验。研究不同温度对菌体洗脱的影响，分别于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃下检测样品中有效活菌数量；研究不同转速对菌体洗脱的影响，分别于140rpm、160rpm、180rpm、200rpm、220rpm震荡后检测样品中有效活菌数量；研究不同pH对菌体洗脱的影响，用不同pH（pH 5.8、6.4、7.2、7.6、8.0）的磷酸盐缓冲液进行菌体的洗脱；研究离子强度对菌体洗脱的影响，在洗脱液中分别加入10 mL不同离子强度的NaCl溶液（0 mM、10 mM、20 mM、40 mM、100 mM）。

2.5 正交试验优化菌体洗脱条件

从单因素中选取对洗脱菌体密度影响较大的几个因素，进行正交优化试验。

3 结果与分析

3.1 不同载体对供试菌的释放效果

草炭、褐煤和鸡粪3种载体对Bacillus megaterium的释放能力有所不同。结果显示，草炭和鸡粪对供试菌的释放显著高于褐煤。因此选用褐煤作为载体进行洗脱优化试验。

表1 不同载体对供试菌释放效果Tab.1Separation effect of different carriers on bacteria

3.2 不同洗脱条件对菌体数量的影响

3.2.1温度对菌体洗脱的影响

如图1所示，随温度的升高，洗脱的菌体数量逐渐增多，40℃时，巨大芽孢杆菌的有效活菌数最高可达2.10×108cfu/g。

图1 温度对菌体洗脱的影响Fig.1Effect of temperature on bacteria elution

3.2.2时间对菌体洗脱的影响

选用不同时间对样品进行洗脱，如图2所示，供试菌的洗脱数量随时间的增加逐渐增加，洗脱30min后变化趋于平缓。

图2 时间对菌体洗脱的影响Fig.2Effect of time on bacteria elution

3.2.3转速对菌体洗脱的影响

如图3所示，转速在140～200rpm，随转速增加，供试菌洗脱菌体数量呈上升趋势，200rpm时菌体洗脱数量可达到最高。

图3 转速对菌体洗脱的影响Fig.3Effect of rotate speed on bacteria elution

3.2.4pH值对菌体洗脱的影响

如图4所示，在一定范围内，菌体的洗脱数随着pH值升高而增多，当pH 7.6时，Bacillus megaterium的洗脱数量最高可达2.28×108cfu/g。

图4 pH对菌体洗脱的影响Fig.4Effect of pH on bacteria elution

3.2.5离子强度对菌体洗脱的影响

由图5所示，载体对供试菌的吸附受溶液中离子强度的影响。随Na+浓度增加，解吸数逐渐降低，Bacillus megaterium的解吸数量最高可达2.28×108cfu/g。

图5 离子浓度对菌体洗脱的影响Fig.5Effect of ionic concentration on bacteria elution

3.3 B.megaterium洗脱条件的正交优化

表2 L9（34）正交设计编码值及水平Tab.2L9（34）Code value and level of orthogonal design

由单因素试验结果可知，温度40℃、洗脱时间40 min时取得较为理想的洗脱效果，随着温度升高和洗脱时间的延长，洗脱的菌体数量基本保持稳定。进一步对其他因素即转速、pH值、离子浓度进行正交优化试验，采用L9（34）正交表，设计及结果见表2。通过极差分析RC＞RA＞RB，说明影响B.megaterium洗脱条件的主要因素依次为离子浓度＞转速＞pH值，其中钠离子浓度对活菌洗脱的影响最大。通过正交试验分析最适洗脱条件组合为A3B2C2即转速为220 rpm、pH值7.6、离子浓度20 mM。在此条件下进行验证试验，洗脱活菌数达到2.31×108cfu/g，显著高于其他正交试验组。

表3 B.megaterium洗脱条件正交试验结果Tab.3Orthogonal experiment result of elution condition of B. megaterium

4 讨论

载体与细菌的吸附存在着复杂的作用方式与过程，是由分子间力、静电力、疏水作用力、氢键和空间位阻效应等多种作用因素共同影响的物理化学过程，其中静电力、疏水作用力起着主导作用。依据吸附理论，菌体在载体上的吸附是可逆的，在总吸附自由能为正值时，会发生解吸。研究发现，土壤黏粒与微生物菌体之间的吸附作用，菌体在黏粒表面的吸附是热力学自发过程［3，4］。因此，微生物和载体的表面性质如表面电荷、疏水性及所处的环境条件如pH、电解质浓度、温度等，都影响着吸附过程。本研究中发现，离子强度对巨大芽孢杆菌具有显著的影响是影响其洗脱的关键因素。当体系pH从5.0上升到8.0，载体对细菌的吸附量是一个降低的过程，变化明显，推断其与静电斥力有关。

［1］李元芳.有效活菌数的测定方法、允许差与判定［J］.土壤肥料，1997，（04）：43-45.

［2］蒋代华，黄巧云，卡蔡鹏，等.粘粒矿物对细菌吸附的测定方法［J］.土壤学报，2007，44（4）：656-662.

［3］周学永，陈守文，吴新世，等.苏云金芽胞杆菌原毒素在蒙脱石上的吸附特性研究［J］.农业环境科学学报，2006，25（4）：992-996.

［4］荣兴民，黄巧云，陈雯莉，等.土壤矿物与微生物相互作用的机理及其环境效应［J］.生态学报，2008，28（1）：376-387.

Optimization of elution conditions of living bacteria in solid microbial fertilizer

ANQi1，2，XUDan-dan3，FENGWei-jian3，YINBo1，2
（1.Institute ofMicrobiology，HeilongjiangAcademyofSciences，Harbin 150010，China；2.Institute ofAdvanced

Technology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150010，China；3.Harbin University，Harbin 150000，China）Abstract:The study aimed to weaken the adsorption between carrier and bacteria in solid microbial fertilizer and improve the elution efficiency of bacteria.Bacillus megateriumwas used as the target bacteria.Brown coal was used as the carrier. We researched on the bacteria elution efficiency via using different temperature，elution time，speed，pH and ionic concentration and ultimately optimize the elution conditions.The results revealed that optimal elution condition forBacillus megateriumwas the rotate speed of 220 rpm，pH7.6 and ionic concentration of 20mM.

Solid microbial fertilizer；Elution；Optimization

TQ446

A

1674-8646（2016）13-0001-03

2016-04-02

黑龙江省科学院青年创新基金

安琦（1988-），女，黑龙江齐齐哈尔人，助理研究员，主要从事农业微生物应用研究。

殷博（1983-），男，黑龙江齐齐哈尔人，助理研究员，主要从事农业微生物应用研究，e-mail：xinyu4026@163.com。