SCI大鼠脊髓前角细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达的变化*

李海艳，孙淑红，程振宇

（承德医学院，河北承德 067000）

SCI大鼠脊髓前角细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达的变化*

李海艳，孙淑红，程振宇

（承德医学院，河北承德 067000）

目的：观察脊髓全横断损伤对脊髓前角细胞Beclin-1表达的影响。方法：雄性Wistar大鼠随机分为模型组和假手术组，建立大鼠第2腰髓全横断损伤模型，分别于损伤后6h、1d、3d、7d、14d、21d取3-4腰髓，采用免疫荧光染色法观察大鼠脊髓前角细胞自噬相关蛋白Beclin-1的表达情况。结果：与假手术组相比，模型组损伤后各时间点大鼠脊髓前角Beclin-1免疫阳性细胞数明显升高（P＜0.01，P＜0.05）。脊髓损伤后3d脊髓前角细胞Beclin-1免疫阳性细胞数达到高峰，21d最低。结论：Beclin-1可能参与了神经元自噬状态的改变。

脊髓损伤；自噬；Beclin-1

随着社会进步，交通、建筑及工矿企业的迅速发展，脊髓损伤（SCI）呈现高发态势，目前尚没有有效的治疗方法。SCI严重者可导致死亡，轻者造成损伤平面以下感觉、运动、自主神经功能障碍，严重影响患者的生活质量，给家庭和社会带来沉重的负担。自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性降解途径，是机体应对不良刺激的一种重要保护机制，对维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定起着重要作用［1］。哺乳动物Beclin-1与早期自噬体形成有关，是其他自噬蛋白基因参与自噬形成过程的必需成分［2］。本研究拟通过建立大鼠腰段（L2）全横断脊髓损伤模型，观察损伤平面下，3、4腰髓脊髓组织Beclin-1的表达量与损伤时间的关系，以期阐明自噬变化在SCI中的保护作用机制，为临床治疗脊髓损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组 清洁级雄性Wistar大鼠35只，体质量250-300g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（合格证号：0003327）。随机分为脊髓全横断损伤后6h、1d、3d、7d、14d、21d组和假手术组，每组5只。

1.2 方法

1.2.1 脊髓全横断损伤模型的建立：10%水合氯醛（300mg/ kg）腹腔注射麻醉大鼠，常规消毒，铺无菌单。以L2棘突为中心，作后正中切口长约3cm，暴露椎板和关节突，咬除棘突及棘间韧带后，在10倍手术放大镜下咬除黄韧带和椎板，暴露硬脊膜并剪开，分离包裹在脊髓表面的神经根，暴露第2腰髓节段，用手术刀片切断脊髓组织，注意保留脊髓背静脉和前、后动脉，镜下确认无纤维连接后，缝合伤口。假手术组只咬除椎板和黄韧带，保留硬脊膜的完整。大鼠术后腹腔注射青霉素预防感染。SCI模型成功的标准是：大鼠后肢瘫痪，鼠尾痉挛性摆动，无规律地卷曲或摆动。大鼠术后分笼饲养，自由进食，每日3次定时手工压迫膀胱、肠道，协助排尿、排便，直至自主排尿、排便。如发现大鼠有血尿，则加用青霉素钠，直到血尿消失。

1.2.2 免疫荧光标本的取材、观察：分别于术后相应的时间点随机选取5只大鼠，麻醉、4%多聚甲醛灌流固定后，取出脊髓组织，移入后固定液固定4-6h，然后置25%蔗糖溶液中至沉底。各组均取第3、4腰髓节段进行冰冻切片，片厚30 μ m，采用免疫荧光染色法观察大鼠脊髓前角细胞Beclin-1（兔抗多克隆抗体，工作浓度1：800）的表达情况。荧光显微镜下观察并摄片。采用Adobe Photoshop CS5分析脊髓前角细胞Beclin-1免疫阳性细胞个数。

1.3 统计分析 采用SPSS 15.0统计软件进行统计处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，模型组不同时间点间的比较采用方差分析、两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与假手术相比，模型组各时间点大鼠脊髓前角Beclin-1免疫反应阳性细胞数明显增加（P＜0.01，P＜0.05）。模型组各时间点大鼠脊髓前角Beclin-1免疫反应阳性细胞数比较，差异有统计学差异（P＜0.05）：SCI后3d脊髓前角Beclin-1阳性细胞数最高，损伤后7d有所降低，至损伤后21d降到最低，但仍然高于假手术组。见附表：

附表 脊髓前角Beclin-1免疫反应阳性细胞数（±s，n=5）

附表 脊髓前角Beclin-1免疫反应阳性细胞数（±s，n=5）

与6h、7d、21d比较：aP＜0.05；与1d、3d比较：bP＜0.05

时间点模型组假手术组P 6h33.00±2.65＜0.01 1d46.00±7.94＜0.05 3d56.67±8.33a＜0.01 7d38.33±13.58＜0.05 14d43.67±4.04＜0.01 21d27.67±7.37b＜0.05 11.00±1.73

3 讨论

SCI指因直接或间接的外界因素导致感觉、运动功能障碍，肌张力异常及出现病理反射等病变。脊髓损伤可分为原发性损伤和继发性损伤［3-4］。原发性损伤由外力直接或间接作用于脊髓造成，主要是神经元的凋亡；继发性损伤是在原发性损伤后数小时或数天，除外力因素造成脊髓水肿、椎管内血肿、压缩性骨折及椎间盘的破碎等造成脊髓组织坏死外，主要包括神经细胞大量死亡，神经纤维脱髓鞘和断裂，空洞和胶质瘢痕形成。与原发性损伤比较，继发性损伤的程度更严重。

自噬是近年来分子生物学研究的热点之一，在营养缺乏和氧化应激时，是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，也是真核细胞特有的生命现象，对于维持细胞内环境的稳定具有重要作用［5］。自噬贯穿于正常细胞的生长发育和病理生理过程，与神经退行性病变、心肌肥厚、肿瘤等疾病有关［6-7］。

哺乳动物Beclin-1是酵母Atg6/Vps30基因的同源物，可与三磷酸肌醇3-激酶（PI3KC3）共同形成一种复合物，参与自噬体的早期形成。目前，Beclin-1已经作为自噬的标志分子用于检测自噬活性［8］。有研究发现，在脊髓半横断损伤后，Beclin-1表达从4h开始增加，到第3d达到顶峰，至少持续21d。本研究建立大鼠脊髓腰段全横断损伤模型，应用免疫荧光技术检测脊髓前角细胞Beclin-1蛋白的表达情况与上述研究结果相似，损伤6h后脊髓前角Beclin-1免疫阳性细胞数明显增加，到3d后达到顶峰，损伤21d表达最低。提示SCI后3d自噬活动最强，随着时间的延长，自噬活动有所降低；说明SCI可引起大鼠脊髓前角细胞自噬活性增强，Beclin-1可能参与了神经元自噬状态的改变。

研究表明，细胞自噬水平的提高是神经细胞对损伤的保护性反应，已在脑外伤模型中得到了证实［9］。大鼠脊髓损伤后Beclin-1蛋白表达增高可能与损伤后神经元的自我保护作用相关，而且在脊髓损伤后不同时间点自噬相关蛋白的表达不同。通过总结损伤后不同时间点自噬水平的变化，探讨自噬变化在SCI中的保护作用机制，可为临床在不同时段进行干预治疗提供理论基础。

［1］韩笑，李丹，林成仁，等.自噬研究新进展［J］.解放军医学杂志，2010，35（10）：1267-1269.

［2］Maiuri MC， Le TG， Criollo A， et al. Functional and physical interaction between Bcl-X（L）and a BH3-like domain in Beclin-1［J］. EMBOJ， 2007， 26（10）: 2527-2539.

［3］Profyris C， Cheema S， Zhang DW， et al. Degenerative and regenerative mechanisms governing spinal cord injury［J］. Neurobiol Dis， 2004， 15（3）: 415-436.

［4］Ankeny DP， Popovich PG. Mechanisms and implication of adaptive immune responses after traumatic spinal cord injury［J］. Neuroscience， 2009， 158（3）:1112-1121.

［5］于大堂，李茗芳，倪兵，等.大鼠脊髓损伤后自噬相关蛋白LC3和BNIP3的表达［J］.第三军医大学学报，2013，35（9）：841-845.

［6］郭兰燕，张英梅.自噬在心血管疾病的研究进展［J］.心脏杂志，2015，27（4）：480-482，489.

［7］刘佳，王佑民，胡红琳，等.自噬与脂联素诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的关系［J］.安徽医科大学学报，2015，50（9）：1223-1228.

［8］袁敏，刘斌，唐静，等.Beclin-1与Bcl在血管性痴呆大鼠海马CA1区的表达及意义［J］.天津医药杂志，2013，41（11）：1092-1094.

［9］Diskin T， Tal-Or P， Erlich S， et al. Closed head injury induces upregulation of Beclin 1 at the cortical site of injury［J］. J Neurotrauma， 2005， 22（7）: 750-762.

CHANGES OF AUTOPHAGY RELATED PROTEIN BECLIN-1 EXPRESSION IN ANTERIOR HORN CELLS OF SPINAL CORD INJURY RATS

LI Hai-yan， SUN Shu-hong， CHENG Zhen-yu
（Chengde Medical College， Hebei Chengde 067000， China）

Objective: To observe the effects of complete transection of spinal cord on Beclin-1 expression in anterior horn cells of rats' spinal cord. Methods: Male Wistar rats were randomly divided into model group and shamoperation group. The spinal cord injury （SCI） rat's model were made by completely transecting the 2ndlumbar spinal cord. Immunofl uorescent staining was used to detect the Beclin-1 protein expression in anterior horn cells of the 3rd-4thlumbar spinal cord 6h， 1d， 3d， 7d， 14d and 21d after injury respectively. Results: Compared with rats in sham-operation group， the Beclin-1 positive cells in anterior horn of spinal cord of rats in model group at each time point increased obviously （P＜0.01，P＜0.05）. The Beclin-1 positive cells in anterior horn of spinal cord reached the peak 3 days after injury， and reached the lowest 21 days after injury. Conclusions: Beclin-1 may be involved in the changes of neuron autophagy.

Spinal cord injury； Autophagy； Beclin-1

R338

A

1004-6879（2016）02-0102-03

* 河北省卫生厅重点课题（20150016），河北省中医药管理局课题（2015153）

（2015-09-01）