春小麦单倍体胚得胚率的影响因素研究

王重，樊哲儒，张跃强，李剑峰，高新，王子霞

(1.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091；2.农业部荒漠绿洲作物生理生态与耕作重点实验室，乌鲁木齐 830091)



春小麦单倍体胚得胚率的影响因素研究

王重1，2，樊哲儒1，2，张跃强1，2，李剑峰1，2，高新1，2，王子霞1

(1.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091；2.农业部荒漠绿洲作物生理生态与耕作重点实验室，乌鲁木齐 830091)

【目的】研究玉米花粉对于春小麦单倍体胚的诱导效率及影响因素，获得稳定且高效的单倍体胚诱导方法，并应用于春小麦育种实践。【方法】使用三种不同基因型玉米分别和不同春小麦品种进行远缘杂交，分别采用两种授粉方式和两种激素处理方式获得单倍体胚。【结果】三种不同基因型玉米与不同春小麦品种均可以获得单倍体胚，爆裂玉米得胚率最高(9.59%)，重复授粉以及重复喷施激素均能够有效增加春小麦单倍体胚的得胚率。【结论】采用爆裂玉米为父本与春小麦进行远缘杂交，间隔24 h重复授粉及重复喷施激素处理，能够有效提高春小麦单倍体胚的得胚率。

小麦×玉米；单倍体胚；基因型

0 引 言

【研究意义】小麦与玉米远缘杂交获得单倍体胚，经过组织培养得到单倍体植株，人工加倍后当年便可获得纯合双单倍体，繁育1年后即可进行品系比较试验，与常规杂交育种相比较能够缩短育种年限3～5年，而且该方法既不会产生白化苗，又避免了基因型的制约[1-3]，是小麦产生单倍体效率最高的途径之一。具有非常良好的育种应用潜力。【前人研究进展】1984年，Zenkteler等[4]报道了小麦与玉米远缘杂交获得球型杂种胚的研究结果，但因未提供细胞学证据而受到质疑Laurie等[5, 6]提供了详细的细胞学证据，表明小麦与玉米远缘杂交后得到的是真正的杂种胚，并通过小穗培养法获得了单倍体植株。20世纪90年代，孙敬三等[7]、陈新民等[8]开展了此方面的研究，获得了单倍体植株。国内很多学者对小麦与玉米远缘杂交进行了研究，包括基因型[9-12]、授粉方式[13]、激素处理[7, 13, 14]、小花穗位[15]等。【本研究切入点】目前研究多以冬小麦为研究对象，针对春小麦的研究尚少见报道。单倍体胚诱导率不稳定是制约该方法应用于育种的主要问题[16]。以春小麦为母本与玉米进行远缘杂交，结合授粉方式和激素处理的比较，研究春小麦与玉米远缘杂交诱导单倍体胚的影响因素。【拟解决的关键问题】以春小麦为母本，利用三种不同基因型的玉米花粉进行远缘杂交，结合授粉方式和激素处理比较，研究春小麦与玉米远缘杂交诱导单倍体胚的影响因素，为春小麦×玉米远缘杂交方法应用于育种实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

春小麦材料XC、126H由新疆农业科学院核技术生物技术研究所提供，不同基因型玉米材料由新疆农业科学院粮食作物研究所提供，分别为爆裂玉米、甜玉米、糯玉米。

1.2 方 法

1.2.1 去雄授粉

2015年4月上中旬，玉米材料分三期覆膜播种，小麦材料4月下旬分两期播种。抽穗后选择即将开花小穗进行整穗、剪颖、去雄、套袋，开花当日收集新鲜玉米花粉使用脱脂棉蘸取进行授粉杂交，授粉采用3种方式：

方式Ⅰ：第一次授粉24 h后，进行第二次玉米花粉授粉，48 h后以小花柱头喷施方式进行第一次激素处理，72 h进行第二次激素处理。

方式Ⅱ：进行第一次玉米花粉授粉后，24 h后进行激素处理。

方式Ⅲ：玉米花粉授粉后，24 h后以小花柱头喷施方式进行第一次激素处理，48 h进行第二次激素处理。

1.2.2 剥胚培养

将授粉15 d的小穗剪下取回，将籽粒剥出，使用70%乙醇消毒1 min，无菌水洗涤3次，再使用0.1% HgCl2消毒8 min，无菌水洗涤5次，接种于1/2 MS培养基上暗培养7 d，此时胚体积明显增大，部分胚已萌发，移至正常光照下培养直至分化成苗。

1.3 数据统计

计算结实率、结实颖果得胚率和得胚率。

结实率=结实颖果数/授粉颖花数×100%。

结实颖果得胚率=单倍体胚数/结实颖果数×100%。

得胚率=单倍体胚数/授粉颖花数×100%。

2 结果与分析

2.1 结实率及单倍体胚的获得频率

研究表明，分别使用3个不同基因型玉米花粉与小麦材料进行远缘杂交，共授粉小花2 072朵，经过授粉和激素处理，15 d后剪穗剥胚，得到颖果1 812个，结实率为87.45%，其中得胚65个，得胚率为3.14%。表1

2.2 不同基因型玉米对小麦单倍体胚得胚率的影响

研究表明，就春小麦而言，爆裂玉米、甜玉米、糯玉米与玉米远缘杂交后均能诱导其产生单倍体胚，得胚率分别为9.59%、4.82%和4.35%，结实颖果得胚率分别为11.11%、5.76%和4.88%，爆裂玉米均高于其他基因型玉米，与其他玉米种类之间存在差异；而就结实率而言，糯玉米结实率最高，但不同基因型玉米之间并无差异。结实率、得胚率、结实颖果得胚率三者之间并无相关性。表1

表1 不同基因型玉米对小麦单倍体胚得胚率
Table 1 Effect of different maize genotypes on frequency of embryo formation

品种Varieties授粉小花数No．ofspikeletpollinated结实颖果数No．ofcaryopsis结实率(%)Fre．ofcaryopsis单倍体胚数No．ofhaploidembryos结实颖果得胚率(%)Fre．ofembryoformationofcaryopsis得胚率(%)Fre．ofembryoformation爆裂玉米Puffedmaize3442978634a331111a959a甜玉米Sweetmaize4984178373a24576b482b糯玉米Glutincusmaize1841648913a8488b435b

注：数字后的不同字母表示在5%水平上差异显著。下同

Note：Different letters refer to difference significant at 0.05 level. The same as below

2.3 授粉次数对小麦单倍体胚得胚率的影响

研究表明，春小麦与玉米远缘杂交过程中使用单次授粉和重复授粉两种操作方法，重复授粉得胚率与结实颖果得胚率分别为5.18%和6.08%，均高于单次授粉的3.51%和3.85%，但单次授粉的结实率高于重复授粉，两者之间存在差异，表明在远缘杂交过程中使用重复授粉操作能够有效提高小麦单倍体胚的得胚率。表2

表2 不同授粉次数下小麦单倍体胚得胚率变化
Table 2 Effect of pollinated times on frequency of embryo formation

方法Method授粉小花数No．ofspikeletpollinated结实颖果数No．ofcaryopsis结实率(%)Fre．ofcaryopsis单倍体胚数No．ofhaploidembryos结实颖果得胚率(%)Fre．ofembryoformationofcaryopsis得胚率(%)Fre．ofembryoformation单次授粉Singlepollination1141049123a4385b351b重复授粉Repeatedpollination8507248518b44608a518a

2.4 激素喷施次数对小麦单倍体胚得胚率的影响

研究表明，春小麦与玉米远缘杂交以后单次喷施和重复喷施激素，重复喷施激素得胚率与结实颖果得胚率分别为5.27%和6.19%，均高于单次喷施激素的2.73%和2.97%，但单次喷施激素的结实率高于重复喷施激素，两者之间存在差异，表明在远缘杂交后重复喷施激素能够有效提高小麦单倍体胚的得胚率。表3

表3 不同激素喷施次数下小麦单倍体胚得胚率变化
Table 3 Effect of times of spraying hormones on frequency of embryo formation

方法Method授粉小花数No．ofspikeletpollinated结实颖果数No．ofcaryopsis结实率(%)Fre．ofcaryopsis单倍体胚数No．ofhaploidembryos结实颖果得胚率(%)Fre．ofembryoformationofcaryopsis得胚率(%)Fre．ofembryoformation单次喷施Singlespray1101019182a3297b273b重复喷施Repeatedspray8547278513b45619a527a

3 讨 论

研究采用三种不同基因型玉米与不同品种春小麦材料进行远缘杂交，均能够获得单倍体胚，表明春小麦能够受不同基因型玉米花粉的诱导产生单倍体胚，而且这种诱导并不受玉米基因型的限制，但不同基因型玉米对于小麦单倍体胚的诱导率方面存在差异，得胚率：爆裂玉米>甜玉米>糯玉米，这与王广金等[9]、蔡华等[10, 11]、赵翠荣等[12]的研究并不完全一致，造成这一结果的原因可能是由于不同玉米花粉对于春小麦的诱导能力存在一定差异。

远缘杂交过程中使用玉米花粉对小麦进行重复授粉操作以及重复喷施激素均能够有效的提高小麦单倍体胚的得胚率，这与陈新民等[13]在冬小麦中的研究结果一致，但是试验中重复授粉及重复喷施激素的结实率低于单次授粉和单次喷施激素，造成该结果的原因可能与整穗时间、小穗发育状态、花粉活力以及授粉时间等多种因素有关，今后还需对于这些影响因素进一步研究。

小麦×玉米远缘杂交具有缩短育种年限、不产生白化苗、不受基因型制约等优点，但是目前产生单倍体胚的效率不稳定且太低，制约了该技术在育种实际中的应用。研究中平均得胚率为6.34%，个别处理得胚率不到1%，可见得胚效率可能受到多种因素的制约和影响。蔡华等[17]、来长凯等[18]和陈新民等[19]提出远缘杂交后的生长条件尤其是积温等会对得胚率产生明显的影响，因此若要将小麦×玉米远缘杂交方法应用于育种实践，还需要对得胚率的影响因素进一步进行研究，以便获得较为稳定和高效的得胚方法。

4 结 论

以春小麦为母本与玉米进行远缘杂交，就小麦单倍体胚的得胚率而言，爆裂玉米的诱导率最高，其次是甜玉米，糯玉米诱导率最低。就结实率而言，糯玉米>爆裂玉米>甜玉米。相对于单次授粉，第一次授粉后间隔24 h重复授粉能够有效提高小麦单倍体胚的得胚率，同时，授粉后间隔24和48 h重复喷施激素处理，也能够有效的提高春小麦单倍体胚的获得效率。

References)

[1] Laurie, D. A., & Reymondie, S. (1991). High frequencies of fertilization and haploid seedling production in crosses between commercial hexaploid wheat varieties and maize.PlantBreeding, 106(3):182-189.

[2]陈新民，徐惠君，周俊芳，等. 提高小麦×玉米胚培养植株产生频率的研究[J].中国农业科学, 1996， 29(4):29-32.

CHEN Xin-ming, XU Hui-jun, ZHOU Jun-fang, et al. (1996). A Study on the increasing frequences of plant production during embryo culture in crosses between wheat and maize [J].ScientiaAgriculturaSinica，29(4): 29-32. (in Chinese)

[3]闫贵云，左静静，冯瑞云，等. 玉米花粉诱导小麦单倍体技术研究进展[J]. 山西农业科学, 2015，43(9)：1 204-1 206.

YAN Gui-yun, ZUO Jing-jing, FENG Rui-yun, et al. (2015). The research progress of wheat haploid induced by maize pollen [J].JournalofShanxiAgriculturalSciences,43(9)：1，204-1，206. (in Chinese)

[4] Zenkteler, M., & Nitzsche, W. (1984). Wide hybridization experiments in cereals.Tag.theoretical&AppliedGenetics.theoretischeUndAngewandteGenetik, 68(4):311-315.

[5] Laurie, D. A., & Bennett, M. D. (2011). Wheat × maize hybridization.Genome, 28(2):313-316.

[6] Laurie, D. A., & Bennett, M. D. (1987). The effect of the crossability loci kr1, and kr2, on fertilization frequency in hexaploid wheat x, maize crosses.Theoretical&AppliedGenetics, 73(3):403-409.

[7]孙敬三，刘辉，路铁刚，等. 利用小麦×玉米获得小麦单倍体[J]. 植物学报, 1992，34(11):817-821.

SUN Jing-san, LIU Hui, LU Tie-gang, et al. (1992) The production of haploid wheat plants via wheat×maize hybridization [J].ActaBotanicaSinica，34(11):817-821. (in Chinese)

[8]陈新民，李学渊，徐惠君，等. 小麦×玉米单倍体植株的产生[J]. 北京农业科学, 1993，11(3):7-9.

CHEN Xin-ming, LI Xue-yuan, XU Hui-jun, et al. (1992). The production of haploid wheat plants in wheat×maize cross [J].BeijingAgriculturalSciences，11(3):7-9. (in Chinese)

[9]王广金. 小麦与玉米杂交产生单倍体频率的研究[J] . 麦类作物, 1998，18(6)：12-14.

WANG Guan-jin. (2998)g. The study of haploid frequency produced by wheat and maize cross [J].JournalofTriticeaeCrops，18(6)：12-14. (in Chinese)

[10]蔡华，马传喜，周淼平，等. 小麦与玉米远缘杂交诱导小麦单倍体的研究[J]. 麦类作物学报, 2004，24(2)：11-14.

CAI Hua, MA Chuan-xi, ZHOU Miao-ping, et al. (2004). Induction of wheat haploid through distant hybridization between wheat and maize [J].JournalofTriticeaeCrops，24(2)：11-14. (in Chinese)

[11]蔡华，马传喜，陆维忠. 不同小麦组合与不同玉米基因型远缘杂交诱导小麦单倍体的研究[J]. 作物杂志, 2005，(3)：67-69.

CAI Hua, MA Chuang-xi, LU Wei-zhong, et al. (2005). The research of wheat haploid induced in hybridization between different combinations of wheat and different genotypes of maize [J].Crops，(3)：67-69. (in Chinese)

[12]赵翠荣，刘莹，王立峰，等. 基因型对小麦×玉米单倍体胚产生频率的影响[J]. 湖北农业科学, 2014，53(24)：5 935-5 938.

ZHAO Cui-rong, LIU Ying, WANG Li-feng, et al. (2014). Effects of genotypes on frequencies of producing haploid embryo of wheat×maize [J].HubeiAgriculturalSciences，53(24)：5，935-5，938. (in Chinese)

[13]陈新民，陈孝. 小麦×玉米产生单倍体及双单倍体研究进展[J]．麦类作物, 1998，18(3)：1-4.

CHEN Xin-ming, CHEN Xiao. (1998). The research progress of producing double haploid and haploid of wheat×maize [J]．JournalofTriticeaeCrops，18(3)：1-4. (in Chinese)

[14]张新玲，高桂华，石书兵，等. 2，4-D对玉米花粉诱导小麦单倍体得胚率的影响[J]. 甘肃农业大学学报, 2007，42(3)：44-46.

ZHANG Xin-ling, GAO Kui-hua, SHI Shu-bing, et al.(2007). Gulijiemila. Effects of 2，4-D on the embryognesis rate of wheat haploid induced by maize pollen [J].JournalofGansuAgriculturalUniversity，42(3)：44-46. (in Chinese)

[15]刘琨，李宏生，李绍祥，等. 小麦玉米杂交中麦穗小花穗位间的成胚率差异研究[J]. 麦类作物学报, 2014，34(5)：591-596.

LIU Kung, LI Hong-sheng, LI Shao-xiang, et al. (2014). Differences of the haploid embryo rate among floret positions in wheat×maizi crosses [J].JournalofTriticeaeCrops，34(5)：591-596. (in Chinese)

[16]顾坚，刘琨，李绍祥，等. 小麦×玉米杂交诱导小麦单倍体的割穗离体培养研究[J]. 麦类作物学报, 2008，28(1)：1-5.

GU Jiang, LIU Kun, LI Shao-xiang, et al. (2008). Study on the in vitro culture of cut plant in wheat haploid embryo induction by wheat×maize cross [J].JournalofTriticeaeCrops，28(1)：1-5. (in Chinese)

[17]蔡华，马传喜，司红起，等. 提高小麦×玉米产生的单倍体成胚率的研究[J]. 麦类作物学报, 2005，25(6)：20-24.

CAI Hua, MA Chuan-xi, SI Hong-qi, et al. I2005). Study on increasing frequency of haploid embryo production through wheat×maize [J].JournalofTriticeaeCrops，25(6)：20-24. (in Chinese)

[18]来长凯，王成社，闫林. 冬小麦×玉米远缘杂交产生小麦单倍体胚的研究[J]. 麦类作物学报, 2007，27(2)：193-196.

LAI Chang-kai, WANG Cheng-she, YAN Lin, (2007). Study on haploid embryo production of wheat by distant hybridization between winter wheat and maize [J].JournalofTriticeaeCrops，27(2)：193-196. (in Chinese)

[19]陈新民，王凤菊，李思敏，等. 小麦与玉米杂交产生小麦单倍体与双单倍体的稳定性[J]. 作物学报, 2013，39(12)：2 247-2 252.

CHEN Xin-ming, WANG Feng-jü, LI Si-min, et al. (2013). S
Table production of wheat haploid and doubled haploid by wheat × maize cross [J].ActaAgronomicaSinica. 39(12)：2,247-2,252.(in Chinese)

Fund project:Supported by Youth Science Fund Projects of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2013211B23)

Analysis of Influencing Factors on Embryo Rate of Haploid Embryos in Spring Wheat

WANG Zhong1，2, FAN Zhe-ru1，2, ZHANG Yue-qiang1，2,LI Jian-feng1，2, GAO Xin1，2, WANG Zi-xia1

(1.ResearchInstituteofNuclearandBiologicalTechnologies,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China; 2.KeyLaboratoryofCropEcophysiologyandFarmingSysteminDesertOasisRegion,MinistryofAgriculture,Urumqi, 830091,China)

【Objective】 In order to explore the induction efficiency and influencing factors of spring wheat haploid embryo induced by maize pollen, obtain s
Table and efficient method for inducing haploid embryos applied to spring wheat breeding. 【Method】 Distant hybridization was performed using three different maize genotypes and different spring wheat varieties and two kinds of pollination methods and two kinds of hormone treatments were used to induce haploid embryos. 【Result】 Spring wheat haploid embryos could be induced by three genotypes of maize and different varieties of spring wheat, the highest rate (9.59 %) was puffed maize, and repeated pollination and repeated spraying hormones could effectively increase the yield of haploid embryos of spring wheat. 【Conclusion】 The rate of spring wheat haploid embryo could be effectively increased by puffed maize as pollen supplier, repeated pollination and repeated spraying hormones at 24 h interval.

wheat × maize cross; haploid embryo; genotype; influence

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.08.005

2016-03-08

新疆维吾尔自治区青年科学基金项目(2013211B23)

王重(1982-)，男，陕西长安人，助理研究员，研究方向为小麦遗传育种，(E-mail)wangzhongac@126.com

樊哲儒(1964-)，男，甘肃民勤人，研究员，研究方向为小麦遗传育种，(E-mail)fzr518@163.com

S513

A

1001-4330(2016)08-1404-05