转染ClC-3 siRNA的大鼠成骨细胞增殖、分化观察

李琴，何伶俐，陈婷婷，龙密密，王诚

(六盘水市人民医院，贵州六盘水 553001)



转染ClC-3 siRNA的大鼠成骨细胞增殖、分化观察

李琴，何伶俐，陈婷婷，龙密密，王诚

(六盘水市人民医院，贵州六盘水 553001)

目的 观察转染ClC-3 siRNA的大鼠成骨细胞增殖、分化情况。方法 原代提取成骨细胞，将细胞分为四组,Control组细胞不做任何处理，NC组细胞转染无序siRNA，Lipo组细胞转染LipofectamineTM2000转染试剂，ClC-3 siRNA组细胞转染ClC-3 siRNA,各组细胞加载流体剪切力行力学刺激。采用MMT法检测各组细胞培养24、48、72 h时的光密度值；同时检测各组细胞碱性磷酸酶水平及成骨细胞钙化结节形成能力。结果 与Control组相比，ClC-3 siRNA组细胞各时点光密度值降低(P均<0.01)。ClC-3 siRNA组、Lipo组、NC组、Control组成骨细胞碱性磷酸酶水平分别为(32.434±2.130)、(46.199±1.900)、(47.347±2.500)、(49.540±1.550)U/mL，钙化结节形成能力分别为25.02%±3.46%、36.83%±4.54%、38.45%±4.84%、40.57%±2.22%，ClC-3 siRNA组与Control组相比，P均<0.01。结论 转染ClC-3 siRNA可抑制大鼠成骨细胞的增殖、分化。

基因转染；ClC-3蛋白；成骨细胞；氯通道；流体剪切力；细胞增殖；细胞分化；碱性磷酸酶

离子通道如钙离子通道[1]、钾离子通道[2]等与成骨分化及其相关功能有关，但氯离子通道与成骨的相关作用仍不甚了解。ClC家族属于电压门控类的离子通道，其家族成员ClC-3不仅在细胞容积调控中起重要作用，还与细胞增殖[3]、凋亡[4]、迁移[5]、破骨细胞的细胞内酸化调节[6]等相关。研究[7]报道，氯通道参与成骨细胞的代谢活动。流体剪切力(FSS)是研究骨细胞对力学刺激反应的方法。本研究用ClC-3 siRNA下调ClC-3氯通道蛋白表达，观察转染ClC-3 siRNA的大鼠成骨细胞增殖、分化情况。

1 材料与方法

1.1 试剂 胰蛋白酶、青霉素及链霉素(Hyclone，美国)；ClC-3一抗是兔源的多克隆抗体(Abcam，美国)；β-actin一抗购自博士德生物科技有限公司；二抗山羊抗兔IgG(H+L)购自碧云天公司(上海，中国)；碱性磷酸酶(ALP)染液D001-1购于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 成骨细胞培养、鉴定 取4只36 h内出生的SD大鼠，拉颈处死，置75%乙醇浸泡20 min。取头盖骨置于无菌PBS液中，仔细刮除表面骨膜、血管等结缔组织，将头盖骨剪碎至1 mm3大小，转移至15 mL离心管，1 000 r/min离心，去上清。加入0.25%胰酶溶液，37 ℃消化15 min。加入200 U/mL胶原酶Ⅰ消化液，37 ℃震荡60 min。加入含10%胎牛血清(Gibco，美国)的DMEM(Gibco，美国)完全培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，去上清。加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，转移至培养瓶，37 ℃、5%CO2、饱和湿度下培养，待细胞长到占培养皿的80%左右时进行细胞传代，每隔2～3 d传代1次。取第3代的细胞，进行鉴定。将细胞接种在12孔板，48 h后按照ALP染液操作说明书进行鉴定。倒置相差显微镜(Olympus CKX41，日本)观察，拍照，非贴壁的成骨细胞呈球形，悬浮于培养液中并逐渐沉降贴壁，刚贴壁的活细胞形态呈不规则多角形，细胞核单核呈卵圆形，慢慢长汇合时细胞呈铺路石状，并可重叠生长，细胞核呈淡绿色，胞质呈现红色至红棕色，提示成功提取成骨细胞。

1.2.2 细胞分组及ClC-3 siRNA转染 转染前1 d将对数生长期的细胞用不含抗生素的培养液制成细胞悬液，接种于6孔板中，过夜。将细胞分为四组，Control组细胞不做任何处理，NC组细胞转染无序siRNA，Lipo组细胞转染LipofectamineTM2000转染试剂，ClC-3 siRNA组细胞转染ClC-3 siRNA。本研究中的ClC-3 siRNA为对应于鼠源的ClC-3氯离子通道基因的siRNA双链，由苏州吉玛基因股份有限公司合成，正义链序列：5′-CGAGAGAAGUGUAAGGACATT-3′，反义链序列：5′-UGUCCUUACACUUCUCUCGTT-3′。NC组正义链序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。用不含血清和抗生素的DMEM培养液稀释LipofectamineTM2000和20 μmol/L siRNA，每孔用量分别为5、10 μL，室温孵育5 min；将siRNA悬液和LipofectamineTM2000悬液混合，再孵育20 min；用不含血清和抗生素的DMEM培养液洗涤细胞3次，6孔细胞培养板每孔加入1 600 μL无血清和抗生素的DMEM培养液，将LipofectamineTM2000和siRNA混合液缓慢滴加到各孔内，使终浓度为100 nmol/L，细胞继续培养6 h后换正常培养液，共培养48 h。大鼠成骨细胞ClC-3蛋白检测采用Western blotting法。常规方法提取上述四组细胞总蛋白。将得到的蛋白进行BCA蛋白定量及变性，每孔加样20 μL(约含40 μg总蛋白)，用10%的SDS-PAGE进行电泳和半干转膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h，ClC-3兔多克隆抗体和β-actin 4 ℃孵育过夜；TBST漂洗3次，每次10 min；然后与山羊抗兔IgG(H+L)二抗室温孵育1 h，用TBST进行3次漂洗，每次10 min。采用ECL化学发光法进行显影。Image J 软件进行图像分析，测定灰度值，以β-actin为内参，计算相对比值。发现ClC-3 siRNA组较Control组的ClC-3蛋白表达下降(P<0.01)，NC组、Lipo组与Control组ClC-3蛋白表达差异无统计学意义。

1.2.3 大鼠成骨细胞FSS加载方法 用细胞拉应力、压应力、流体切应力加载分析系统(FX-5000，Flexcell，美国)加载FSS。系统以流室系统和灌流系统的其他部分组成完整的闭合环路，蠕动泵提供负压动力，推动灌流液循环。以2×104/cm2的密度将转染中的上述四组细胞接种在预置于培养皿中的长方形(50 mm×20 mm×0.20 mm)盖玻片上，加入完全培养液，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养过夜，使细胞贴壁融合生长。将盖玻片放入流室系统(预先紫外线照射1 h)的方形槽中，流经成骨细胞的切应力、流量以及流室之间的关系公式为τ=6Qμ/bh2。其中τ为腔底切应力(细胞所受的力，dyne/cm2)，Q为循环液流量(cm3/s)，μ为循环液黏度(0.01 dynes/cm2)，b为流室宽度(约为2 cm)，h为流室高度(约为0.025 cm)。调整蠕动泵转速为28 r/min，通过流动腔流量Q为49.7 mL/min(0.833 cm3/s)，根据上述公式得出τ约为1.2 Pa(1.2 Pa=12 dyne/cm2)。加载时间为30 min/次，每隔24 h一次，持续72 h，相当于人每天运动30 min，模仿替代骨骼所受的生理刺激。

1.2.4 成骨细胞增殖能力观察 MTT法检测细胞增殖能力。按每孔100 μL、细胞悬液浓度为2.5×107cells/L处理后的细胞加入96孔培养板。分别观察培养24、48、72 h后的OD值。在检测OD值前加入MTT液10 μL/孔(5 g/L)，37 ℃孵育4 h，弃去液体，每孔加入100 μL盐酸异丙醇溶解15～30 min，全自动酶标仪测定570 nm波长的OD值。OD值代表细胞增殖能力。

1.2.5 成骨细胞ALP测定 取上述处理后的四组细胞，消化，制成3×104～5×104/mL浓度的细胞悬液，按每孔100 μL加到96孔培养板中培养过夜。待细胞贴壁后，吸出96孔培养板的旧培养基，PBS洗2～3遍，按分组更换成已配置好的转染培养基，每组设复孔5个，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中培养72 h。根据南京建成公司生产的ALP测定试剂盒稍作改良进行检测，并计算ALP浓度。

1.2.6 成骨细胞钙化功能观察 取上述处理后的四组细胞，消化，同样制成3×104～5×104/mL浓度的细胞悬液，按每孔500 μL接种于24孔培养板中培养过夜。待细胞贴壁后，倒弃培养基，PBS洗2～3遍，按实验分组更换成已经配置好的转染培养液，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中培养21 d，每2～3 d更换1次转染培养液。培养至第21天时，倒弃培养基，PBS小心洗3次，加95%乙醇固定10 min。PBS轻轻反复洗涤5次，每次5 min。每孔加入0.1%茜素红S(溶解于pH 8.3的Tris盐酸)进行染色，置37 ℃培养箱孵育30 min。单蒸水洗3次，晾干。倒置显微镜下观察，拍照,计算染色面积。

2 结果

2.1 各组成骨细胞OD值比较 结果见表1。

表1 不同培养时间各组成骨细胞OD值比较±s)

注：与Control组相比，*P<0.01。

2.2 各组成骨细胞ALP水平比较 ClC-3 siRNA组、Lipo组、NC组、Control组成骨细胞ALP浓度分别为(32.434±2.130)、(46.199±1.900)、(47.347±2.500)、(49.540±1.550)U/mL，ClC-3 siRNA组与Control组相比，P<0.01。

2.3 各组成骨细胞钙化功能比较 ClC-3 siRNA组、Lipo组、NC组、Control组钙化结节形成能力分别为25.02%±3.46%、36.83%±4.54%、38.45%±4.84%、40.57%±2.22%，ClC-3 siRNA组与Control组相比，P<0.01。

3 讨论

人体的骨骼是一个具有很强调节能力的力学稳态调控系统[8]，能随着日常生活中环境的变化而不断地自我调整，以适应不断变化的生物力学需求。骨组织对力学刺激敏感，能够感受到各种力学信号的传导，而且成骨细胞的细胞形态、分化和增殖也均与力学刺激相关[9]。FSS能促进成骨细胞增殖，并明显促进细胞分化[10]。Pavalko等[11]认为骨细胞的陷窝-小管结构可以感受机械负荷引起的小管内FSS，改变细胞膜的现状。目前认为骨细胞感受应力的主要方式是FSS使细胞发生形变，引发局部的电位改变，形成力学和电化学耦联，介导力学信号在细胞内的传导。骨组织中，能够将机械刺激信号转变为生化信号的传感器可能是成骨细胞、骨细胞和骨衬里细胞。张力对骨组织的作用受到很多因素的影响，如力的大小、作用时间和速率等。一般加载的力小但时间长与较大而作用时间短的应力产生的蛋白合成效应结果相似[12]。氯通道参与成骨细胞的分化调节过程，小鼠成骨细胞MC3T3-E1在骨诱导分化过程中，高表达ClC-3氯通道蛋白，促进成骨分化[7]。另有文献[13]报道，骨硬化病是由于缺乏氯通道家族亚型中的ClC-7所导致。

骨骼细胞力学传导的重要组成成分包括调节一氧化氮和前列腺素E2的多囊肾蛋白2[14]、嘌呤信号途径[1]、β-catenin在胞质内积聚[15]等，进而启动核转录因子，发挥调控作用。本研究中的大鼠成骨细胞通过力学装置加载FSS,模仿人体骨骼正常每天运动时所受的生理刺激。ClC-3氯通道是容积敏感性氯通道，与细胞容积调节、增殖、凋亡、周期、迁移或骨细胞内酸化调节密切相关。本研究主要探讨ClC-3氯通道参与成骨细胞力学信号传导可能机制，阐明ClC-3氯通道是否介导了FSS促进成骨细胞的增殖和分化。

本研究通过原代提取小鼠头盖骨成骨细胞，用ClC-3 siRNA下调ClC-3氯通道蛋白表达，观察下调ClC-3氯通道对FSS刺激成骨细胞增殖和分化的影响，探讨ClC-3作为FSS促进成骨细胞增殖和分化可能的潜在靶点。结果显示，倒置显微镜下，成骨细胞呈不规则多角形，细胞核单核呈卵圆形，可重叠生长；ALP鉴定成骨细胞阳性反应为胞质中呈现红色至红棕色，提示成功提取成骨细胞。ClC-3 siRNA组的ClC-3蛋白的表达明显下降。在确认ClC-3氯通道成功下调后，观察下调ClC-3氯通道对FSS刺激成骨细胞增殖和分化的影响。FSS能促进成骨细胞的增殖，伴随明显的促进细胞分化[10]。那么氯通道是否参与了FSS促进成骨细胞的增殖？本研究结果显示，下调ClC-3氯通道蛋白表达后成骨细胞增殖明显被抑制，提示ClC-3可能介导了FSS促进成骨细胞的增殖。骨型ALP是成骨细胞分化和功能的标志物。钙化结节形成能力是反映成骨细胞分化成熟功能的关键指标，通过茜红素S染色，显示钙化结节。茜红素S能与钙化结节中的钙离子螯合，产生桔红色沉积，桔红色沉积即是钙化结节。骨型ALP和钙化结节均是成骨细胞分化形成成熟骨细胞能力的关键指标。实验结果显示，ClC-3 siRNA组能明显阻抑ALP的分泌并阻抑钙化结节形成，推测ClC-3可能介导了FSS促进成骨细胞的分化。

哺乳动物对外界的环境极为敏感，能感受并传导化学或力学信号。其中骨细胞对力学刺激尤为敏感，成骨细胞力学信号传导的机制一直被研究，离子通道是学者们关注的焦点。离子通道的开放和关闭与力学刺激有关。FSS诱导的ATP释放依赖于L型电压敏感性钙通道的开放使得钙离子的进入细胞[1]。细胞与细胞之间的信号转导，如嘌呤信号途径[1]、β连环素在胞质内大量积聚[15]，增强缝隙连接和细胞内钙释放等，都是成骨细胞感受机械刺激并作出力学传导的早期事件[16]。另外，机械刺激能产生一氧化氮，而一氧化氮的产生能增强骨骼强度和断裂阻力，使得骨量和骨结构做出相应变化，以适应机械的刺激[17]。

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Observation of cell proliferation and differentiation in rat osteoblasts tranfected by ClC-3 siRNA

LIQin,HELingli,CHENTingting,LONGMimi,WANGCheng

(ThePeople'sMunicipalHospitalofLiupanshui,Liupanshui553001,China)

Objective To observe the cell proliferation and differentiation in rat osteoblasts which were transfected by ClC-3 siRNA.Methods The primary osteoblasts were extracted and divided into 4 groups: the control group which was not treated, negative control (NC) group which was transfected by unordered siRNA, Lipo group which was transfected by lipofectamineTM2000 transfection reagents only and the ClC-3 siRNA group which was transfected by ClC-3 siRNA. All cells were cultured in the flow shear stress installation. The optical density (OD) values at 24, 48 and 72 h after culture in each group were detected by MTT. The alkaline phosphatase level and calcified nodule was also detected. Results Compared with the control group, the OD value of the ClC-3 siRNA group was decreased at each time points (allP<0.05). The alkaline phosphatase levels and calcified nodule forming abilities in the ClC-3 siRNA, Lipo, NC and control groups were (32.434±2.130), (46.199±1.900), (47.347±2.500) and (49.540±1.550) U/mL, and 25.02%±3.46%, 36.83%±4.54%, 38.45%±4.84% and 40.57%±2.22%, respectively. Significant difference was found between the ClC-3 siRNA group and the control group (allP<0.01).Conclusion After transfection of ClC-3 siRNA, the cell proliferation and differentiation of rat osteoblasts is inhibited.

gene transfection; ClC-3 protein; osteoblasts; chloride channel; flow shear stress; cell proliferation; cell differentiation; alkaline phosphatase

李琴(1987-)，女，硕士，初级技师，主要从事免疫及分子生物学研究。E-mail: pan417076448@qq.com

简介：王诚(1967-)，男，主任技师，主要从事免疫及分子生物学研究。E-mail: jywangcheng@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.007

R331

A

1002-266X(2016)35-0024-04

2015-08-23)