RP-HPLC测定间苯三酚栓剂含量*

黄益艳，廖丽云， 许小红

成都医学院 药学院 (成都 610083)



·论 著·

RP-HPLC测定间苯三酚栓剂含量*

黄益艳，廖丽云△， 许小红

成都医学院 药学院 (成都 610083)

目的 建立同时测定间苯三酚(phlorogluciol,PG)栓剂中两种成分含量的方法。方法 采用RP-HPLC法，色谱柱为Nuanalytical C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-磷酸二氢钾溶液(磷酸调 pH值为 3.0)，梯度洗脱，检测波长265 nm，柱温30 ℃。结果 PG、三甲基间苯三酚(trimethylphlorogluciol,TMP)tR分别为4.1和9.3 min；PG在6.02～40.16 μg·mL-1浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，TMP在6.05～40.32 μg·mL-1浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。线性方程分别为y=45.919x+0.080(R2=0.999 9)、y=49.424x-0.291(R2=0.999 7)。平均回收率分别为99.97% (RSD=0.67%，n=9)、100.34%(RSD=1.2%，n=9)。结论 本方法简便、准确、专属性好，可同时测定PG栓剂中两种成分含量。

反相高效液相色谱法；间苯三酚；三甲基间苯三酚；间苯三酚栓剂；含量测定

间苯三酚(phlorogluciol，PG)是一种亲肌性非阿托品非粟碱类纯平滑肌解痉药，能直接作用于胃肠道和泌尿生殖道的平滑肌[1-2]。PG多与三甲基间苯三酚(trimethylphlorogluciol，TMP)联合使用，两者可以抑制儿茶酚-O-甲基转移酶，减少平滑肌痉挛，从而缓解疼痛[3]。其特点是解除平滑肌痉挛的同时不会产生一系列抗胆碱样不良反应,且只作用于痉挛平滑肌，对正常平滑肌影响很小[4]。临床上主要用于治疗消化系统和胆道功能障碍引起的急性痉挛性疼痛,已成为治疗痉挛性疼痛的首选药[5]。

文献报道的 PG 分析方法通常有荧光法、薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法等[6]，国外有关于PG片剂的含测，未见有对PG栓剂的含测。由于 PG 与 TMP 极性相差较大，同时栓剂基质对含量测定易产生干扰，因此，本文重点筛选了色谱条件及样品处理方法,进行了全面的方法学验证，建立了PG栓剂含量测定的高效液相色谱法，为本品质量研究提供方法学参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

HPLC 系统(包括 Dionex ultimate 3000 四元泵，Dionex ultimate 3000 自动进样器，Dionex ultimate 3000 二极管阵列检测器，变色龙色谱工作站，美国戴安中国有限公司Ultimate 3000)NuAnalytical C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；优普系列超纯水器(UPH-II-10T,四川优普超纯科技有限公司)；PG二水合物对照品(中检所，420011-201401，纯度77.7%)；TMP对照品(中检所，101022-201302，纯度100%)；自制栓剂(20160701，20160702，20160703) 磷酸二氢钾(成都市科龙化工试剂场，2014071901)；乙腈(色谱纯)；其余试剂均为分析纯。

1.2 溶液的制备

对照品溶液：精密称取 PG、TMP 对照品各 25 mg 置于 25 mL 容量瓶中，加流动相(乙腈：磷酸盐缓冲液1∶1)溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液：取PG栓剂 10 粒，精密称定，置于小烧杯中，于 55 ℃水浴锅中加热熔化。充分搅拌均匀，放冷至室温，切成碎片。精密称定适量(相当于 PG、TMP 各约 20 mg) 置于 100 mL 容量瓶中，加热融化后加流动相(乙腈∶磷酸盐缓冲液=1∶1)40 mL， 超声 20 min 左右，待基质完全溶解，冷却至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.3 色谱条件

采用 NuAnalytical C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)； 流动相 A 为乙腈，流动相 B 为磷酸二氢钾溶液，梯度洗脱，程序见表1，检测波长为265 nm；柱温为 30 ℃，进样量 20 μL。

1.4 方法的专属性

1.4.1 空白辅料干扰性试验 分别取按处方配比的基质、PG 对照品、TMP 对照品、PG栓剂溶液各 20 μL，按 “1.3”项色谱条件进行测定。结果各色谱峰均分离很好，基质在该色谱条件下无吸收，不会干扰样品的测定(图1A～C)。

表1 梯度洗脱程序

1.4.2 酸破坏试验 分别取 PG、TMP 对照品适量，加入2 mL 浓度为1 mol·L-1HCL，摇匀，室温放置 0.5 h，用 1 mol·L-1NaOH 溶液中和，用流动相稀释至刻度，过滤，按“ 1.3 ”项色谱条件测定。结果 PG 在酸破坏条件下产生杂质，主峰与各杂质峰能有效分离，TMP 酸破坏条件下较稳定，未产生明显杂质(图 1D)。

1.4.3 碱破坏试验 分别取 PG、TMP 对照品适量，加入 2 mL 浓度为1 mol·L-1NaOH，摇匀，室温放置 0.5 h，用浓度为 1 mol·L-1HCL 中和，用流动相稀释至刻度，过滤，按“ 1.3 ”项色谱条件测定。结果碱破坏的 PG、TMP 均与其杂质峰分离良好 (图 1E)。

1.4.4 氧化破坏试验 分别取 PG、TMP 对照品适量于 10 mL 容量瓶中，加入 2 mL 浓度为 30% 的双氧水，摇匀，室温放置 1 h，用流动相稀释至刻度，过滤，按“1.3”项项色谱条件测定。结果 PG、TMP 氧化破坏均未产生杂质(图 1F)。

1.5 线性关系的考察

精密吸取 PG、TMP 对照品溶液适量，将其逐渐稀释制成 0.40、0.30、0.20、0.10、0.08和0.06 mg·mL-1的 PG、TMP 系列标准溶液，过滤，按“1.3”项色谱条件测定，记录色谱图。以样品浓度对峰面积进行回归，回归方程分别为AP=45.919 C+0.080(R2=0.999 9)、 ATMP=49.424 C-0.291(R2=0.999 7)。 范围分别为6.02～40.16 μg·mL-1和6.05～40.32 μg·mL-1。

1.6 回收率试验

分别精密称取 PG、TMP 对照品各 9 份，按处方比例加入基质，按供试品方法配制成高、中、低3种浓度的样品溶液，过滤，照“1.3”项色谱条件测定，用回归方程计算回收率(表2)。

表2 PG回收率试验结果(n=9)

1.7 精密度试验

分别取线性下 0.3 mg·mL-1PG、TMP 对照品溶液。照“ 1.3 ”项色谱条件，重复进样 6次，结果见表3。PG 和 TMP 峰面积的 RSD 分别为0.21%和0.08%(n=6)，结果表明本方法进样精密度良好。

1.8 重复性试验

分别精密量取供试品贮备液 2、3和4 mL置于3个 25 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，制得 3 个不同浓度的供试品溶液，照“1.3”项色谱条件进样，每个样品平行测定3次，记录峰面积。结果见表4。结果表明：PG 平均标示量含量为 101.78%，RSD为 0.90%；TMP 平均标示量含量为 100.67%、RSD 为 0.92%，本法重复性良好。

图1 HPLC 方法专属性考察图谱

注：A．混合标准品，1.PG，2.TMP； B.自制PG栓剂, 1.PG，2.TMP；C.空白基质；D1.PG酸破坏，D2.TMP酸破坏；E1. PG碱破化，E2. TMP 碱破坏；F1. PG氧化破坏，F2. TMP氧化破坏

表3 溶液精密度试验结果

表4-1 PG含量测定重复性结果

表4-2 TMP含量测定重复性结果

1.9 溶液稳定性试验

取“1.2”项供试品溶液 20 μL按“1.3”项色谱条件分别在 0、1、2、4、6、8和10 h 内测定。结果见表5。PG、TMP 峰面积的 RSD 分别为 0.56%、0.62%，结果表明 PG、TMP 在10 h内稳定。

表5 溶液稳定试验结果

1.10 耐用性

分别在不同品牌批号的色谱柱、pH=2.8、3.0和3.2 的磷酸缓冲液， 28、30和32 ℃ 柱温下测定 PG、TMP 含量。结果显示理论塔板数均大于 10 000， 拖尾因子<1.5，PG、TMP 含量的 RSD 均<2%。结果表明将色谱条件中磷酸盐缓冲液 pH 值、柱温及色谱柱的品牌型号等做微小变化对测定结果不会产生显著性影响，表示该方法的耐用性好。

1.11 3批小试测定结果

采用本文建立的 HPLC 法对3批自制栓剂的 PG、TMP 含量进行测定，结果该方法能较好的同时满足PG、TMP 含量测定的要求。结果稳定、准确，可作为PG栓剂的质量控制方法。结果见表 3。

表6 3批小试样品含量测定结果

2 讨论

本文对甲醇-磷酸盐缓冲液和乙腈-磷酸盐缓冲液流动相体系进行了比较研究，结果显示乙腈-磷酸缓冲液明显优于甲醇-磷酸盐缓冲液，并对等度洗脱与梯度洗脱进行了对比分析。由于采用等度洗脱PG和TMP的极性相差较大，致出峰时间间隔长。而采用梯度洗脱可明显缩减两个物质的出峰时间间隔，因此本文色谱条件采用梯度洗脱。开始流速设为0.7 mL·min-1，少见于PG含量测定的其他报道，主要原因是将流速设为1.0 mL·min-1，PG极性大导致出峰时间过早，理论塔板数低。但在0.7 mL·min-1流速下,目标峰与杂质峰完全分开,且理论板数>9 000。 因此本文色谱条件将开始流速设定为0.7 mL·min-1。

本文对PG和TMP进行强制降解实验，包括酸破坏、碱破坏和氧化破坏，并对破坏条件包括破坏的强度和时间进行考察，最终确定破化试验方法。在该色谱条件下PG和TMP能产生杂质且其主峰与各杂质峰均能有效分离，具有较好的专属性。

栓剂由药物与基质组成，油脂性基质对药物测定有影响，因此在含量测定时减少基质影响很重要。本实验样品处理的方法为先将样品在55 ℃ 水浴锅中融化，待融化后用流动相乙腈与磷酸缓冲液1∶1溶解，将其置于超声机中超声20 min左右，至基质全部溶解且无絮状物后即可，白色絮状物存在会吸附一部分药物导致含量偏低。待其冷却至室温后定容。用45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

试验结果表明在本试验的色谱条件下，PG回收率高，耐受性好且可以充分的分离出PG、TMP及其破坏后的有关物质，具有较好的专属性，能满足PG和TMP含量测定的要求，可作为PG栓剂的质量控制方法。

[1] 李健和, 易利丹,彭六保,等.间苯三酚的药理作用与临床应用[J]. 中国新药与临床杂志,2011,30(7):494.

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A Study on the Content Determination of Phloroglucinol Suppository by RP-HPLC

Huang Yiyan, Liao Liyun△, Xu Xiaohong.

School of Pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China

Objective To establish a RP-HPLC method to determine the content of phloroglucinol and trimethylphloroglucinol simultaneously in phloroglucinol suppository. Methods High performance liquid chromatography (HPLC) was adopted with the Nuanalytical C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) as the chromatographic column, the acetonitrile-potassium dihydrogen phosphate solution with the pH of 3.0 adjusted with phosphoric acid as the mobile phase, the gradient elution, the detection wavelength of 265 nm, and the column temperature of 30 ℃. Results The phloroglucinol tR is 4.1 min and the trimethylphlorogluciol tR is 9.3 min. The linear range of phloroglucinol was 6.02-40.16 μg·mL-1and that of trimethylphloroglucinol was 6.05-40.32 μg·mL-1. The linear equations wereY=45.919x+0.080(R2=0.999 9),Y=49.424x-0.291(R2=0.999 6) respectively. The average recovery rate of phloroglucinol was 99.97% (RSD 0.67%,n=9) and that of Trimethylphloroglucinol was 100.34% (RSD 1.2%,n=9). Conclusion The established method is simple, accurate and specific in determining the content of phloroglucinol and trimethylphloroglucinol in phloroglucinol suppository.

High performance liquid chromatography; Phloroglucinol; Trimethylphloroglucinol; Phloroglucinol suppository; Content determination

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161027.1704.050.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.008

四川省教育厅基金(No:16Z009、16Z010)

R927；O657.7+2

A

△通信作者:廖丽云，Email: llyhx@tom.com