MT-3通过激活NF-κB信号通路抑制食管癌病理进展

王海军，陆欣，张彦芬，刘聚良，韩永强

（河北医科大学附属邢台人民医院1.胸外科，2.血液科，河北 邢台 054001）

论著

MT-3通过激活NF-κB信号通路抑制食管癌病理进展

王海军1，陆欣2，张彦芬1，刘聚良1，韩永强1

（河北医科大学附属邢台人民医院1.胸外科，2.血液科，河北 邢台 054001）

目的食管癌的发生与多种基因突变相关，基因的表达异常产生肿瘤，本文集中探讨食管癌的发生发展机制。方法选取河北医科大学附属邢台人民医院2009年7月-2011年2月肿瘤科食管癌患者92例。选取其肿瘤组织及其癌旁组织样本，检测金属硫蛋白3（MT-3）在食管癌组织和其癌旁组织中的表达，在食管癌细胞系中构建过表达MT-3和低表达MT-3的细胞系，检测这些MT-3表达不同时，NF-κB信号通路在其中是否处于激活状态。采用Western blot检测P65、pP65蛋白的表达，免疫荧光检测pP65是否在MT-3过表达时有入核表达。结果定量聚合酶链反应（qPCR）结果显示食管癌肿瘤组织中MT-3的表达高于癌旁组织（P=0.001）。通过qPCR检测构建的高表达和低表达MT-3的食管癌细胞系均成功构建，进而检测P65、pP65，显示在过表达MT-3时，pP65蛋白表达增多，低表达MT-3时pP65蛋白表达减少，P65则显现出相反的结果，且表达均有统计学意义，所以认为MT-3高表达时NF-κB信号激活。免疫荧光检测高表达MT-3的食管癌细胞时，细胞核入核明显增多，进一步说明MT-3激活了NF-κB信号通路。结论MT-3在食管癌中通过激活NF-κB信号通路进而抑制食管癌的病理进程。

MT-3；NF-κB；信号通路；食管癌

食管癌的发生发展是一个复杂的过程，涉及一系列的生理变化，包括细胞凋亡、增殖、转移及侵袭的异常。正常生理条件下，细胞内乙酰化与去乙酰化水平处于动态平衡，而在多种肿瘤中金属硫蛋白3（metallothionein 3，MT-3）活性异常，被募集结合在特定的启动子区，导致一系列基因的转录抑制，涉及细胞增殖、分化、迁移、侵袭转移等相关基因[1-3]。MT-3是一类调节基因转录因子的酶。MT-3是与肿瘤关系最为密切的一种基因，可作用于相应的组蛋白而调节基因转录[4]。文献[5-6]证实肿瘤细胞中MT-3的缺失能使肿瘤细胞周期阻滞在G1期或G2/M期，导致有丝分裂细胞的丢失，细胞生长抑制，及凋亡细胞比例的增加。充分说明了MT-3的表达与肿瘤细胞周期、细胞增殖及凋亡密切相关。

其中MT-3基因定位于人6号染色体，可抑制细胞Cyclin-CDK复合物或细胞增殖抗原的活性，当MT-3蛋白表达的升高，阻止了CyclinD1与CDK4结合，使细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞的增殖[7-8]。研究已证实MT-3作为细胞周期负性调控因子，与食管癌细胞增生、转移有关，并且具有良好的预后价值。NF-κB是一个与炎症相关的信号通路，有人报道肿瘤的发生发展是由炎症慢慢演化而成的，炎症的发生导致机体很多基因表达异常，进而进一步激活相关信号通路[9-10]。很多肿瘤疾病的发生都与NF-κB信号通路密切相关。主要通过外源性的因素导致P65入核增多，进而发生细胞核的磷酸化，激活该信号通路，促进炎症的发生，进一步影响肿瘤的发生发展。

但是MT-3在食管癌中的表达及其发生机制还需更进一步的研究，本研究拟探讨MT-3在食管癌中的发病机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集河北医科大学附属邢台人民医院2009年7月-2011年2月肿瘤科食管癌患者92例作为研究对象。取患者肿瘤组织和癌旁组织。所有患者临床资料完整，包括一般情况、病理诊断、肿瘤分期、治疗方式和生存状况等，有较为完整的随访资料完整，患者各类临床资料均保存良好。

1.2 定量聚合酶链反应（qPCR）

逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，等量组织，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4℃离心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，静置5 min，裂解充分；加入200μl氯仿，振荡器上震荡15 s，放置3 min；12 000 r/min，4℃离心15 min，离心完成后分为3层，取最上层（中间一层为蛋白）至一新的EP管中，在吸取的最上层EP管中加入等体积异丙醇，4℃进行，来回颠倒数次，室温沉淀10 min；12 000 r/min，4℃离心10 min，弃去上清液；加入75%乙醇（DEPC水溶解），混匀液体；7 500 r/min，4℃5 min，弃上清液，小心吸尽液体（此时可以看到白色沉淀即为RNA）；RNA略干后加入20μl DEPC水。用核酸染料法进行实时荧光定量PCR检测MT-3在食管癌中的表达研究。引物序列为：MT-3，正向：GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT，反向：UACU UUGGACAUGACCGGCTT；GAPDH，正向：GCCCTGA GGGCCCGAACTGTTACT，反向：CAGACGCACGGCT TTGACCTTCTT。反应程序为：预变性95℃，10 min；循环中变性95℃，30 s；退火55℃，30 s延伸72℃，30秒，反应40个循环，融解曲线分析。

1.3 稳定转染过表达和低表达的MT-3的食管癌细胞株

将处于对数期的TE-1细胞（购自于ATCC）种于6孔板中，保证每孔细胞量约为3×105，lipo 2000加入5μl用100μl无血清培养基混匀，静置5 min，同时高表达和低表达的MT-3的质粒（购买自广州锐博生物有限公司）12μl于100μl无血清的培养基中混匀，5 min后两者混匀20 min，然后加入1 800μl的无血清培养基，48 h后提取RNA进行检测。过表达和低表达的MT-3的质粒MT-3序列合成于广州锐博生物公司，相应的对照组为该段序列的无意替换。MT-3和U6的引物序列前面已经提及。

1.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）

提取血清蛋白，运用碧云天蛋白试剂盒提取组织蛋白。用BCA进行定量。按照A液∶B液以50∶

1的比例进行配置BCA溶液。取收集的细胞上清2μl，加入18μl PBS，200μl AB混合液。将所有蛋白样品用补足液调至等浓度，同时加入5X的溴酚蓝，占比总体积的1/5。上样前将胶板下的气泡赶走，所有蛋白样品调至等浓度后上样，蛋白上样量保证在一定浓度上进行，同时加入6μl蛋白marker。以初始电压为80V跑浓缩胶，然后升至120 V跑分离胶。在目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm以上结束。浸泡PVDF膜：将PVDF膜泡在甲醇中5 min。恒流250 mA，90 min，然后将膜从电转槽中取出，TBST稍加漂洗，5%脱脂牛奶封闭液中缓慢摇荡1 h。TBST稍加漂洗，一抗孵育过夜，第2天将其放在常温复温40 min，然后TBST漂洗膜3次，每次5 min。根据一抗来源选择二抗，室温轻摇1 h。二抗孵育结束后，用TBST漂洗膜3次，每次5 min。对洗后的PVDF膜发光显影，用ECL发光液进行发光显影，配置方法为A液∶B液1∶1进行配置，进行发光显影。

1.5 免疫荧光检测

组织经过固定后，蔗糖梯度脱水，冷冻切片，切片厚度为6μm，高温修复5 min，待其冷却后，PBS洗涤（3次，每次5 min），10%BSA封闭50 min，加入pP65抗兔一抗（美国CST公司），二抗兔抗鼠（美国CST公司），然后进行DAPI染色，1∶100（美国Santa公司）。

1.6 统计学方法

用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，统计学方法采用t检验，Pearson相关分析，χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MT-3在食管癌中的表达

PCR检测食管癌患者组织标本92例及癌旁食管癌组织标本92例，检测结果发现MT-3在癌组织中高表达，且与癌旁组比较，差异有统计学意义（P= 0.001）。如图1所示，检测结果提示MT-3在食管癌的发生发展中可能扮演者重要的角色。

2.2 MT-3激活NF-KB信号通路

本研究成功构建了MT-3过表达和MT-3低表达的2种食管癌TE-1细胞株，图2A所示为成功构建的MT-3高表达的TE-1细胞系，图2B所示为成功构建的低表达MT-3的TE-1，在2种细胞株中分别检测NF-κB中P65和pP65的蛋白表达。如图2C所示为高表达MT-3的TE-1，相比于对照组，在P65减少的情况下，pP65表达量增多，细胞入核增多，与低表达MT-3的TE-1比较，当转入低表达的MT-3时，pP65表达减少，细胞入核减少，所以从过表达和低表达两方面正反验证了NF-κB信号处于激活状态。

2.3 在MT-3高表达时pP65入核

检测在TE-1细胞系中加入MT-3重组蛋白后NF-κB信号变化。分别在TE-1细胞系中加入DMSO和MT-3重组蛋白，检测结果显示在加入MT-3后pP65入核明显增多，即NF-κB信号被激活，相反在加入DMSO后，TE-1细胞系中pP65基本没有入核，NF-κB信号未被激活。见图3。

图1 MT-3的表达检测

图2 MT-3激活NF-κB信号通路

图3 MT-3激活NF-κB信号

3 讨论

大量的研究证实了MT-3功能异常与多种肿瘤的发生发展密切相关[9]。有学者通过免疫组织化学检测MT-3在170例外科手术切除的原发性肝癌组织及癌旁正常组织表达，发现较肝癌组织中MT-3的表达显著高于癌旁正常组织，并与肿瘤级别密切相关。并且有研究[10-12]证实运用MT-3抑制剂可抑制肝癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌及乳腺癌等一系列恶性肿瘤细胞的生长，诱导其分化或凋亡。这些发现充分说明了MT-3的异常与恶性肿瘤的发生发展密切相关，但是其在食管癌中的作用还未被研究[13]，因此本实验进一步通过qPCR检测MT-3在食管癌中的表达，本次研究结果显示在肿瘤患者中肿瘤组织部位MT-3的表达明显高于其癌旁组织。

NF-κB是一条经典的炎症信号通路相关因子，参与细胞分裂、增殖及凋亡的调控，对炎症或者免疫应答等相关的反应进行调节，NF-κB是一种关键性的转录因子，也参与中枢神经系统众多生理活动或病理过程，如神经元可塑性、炎症、突触传递和疼痛。炎症因子的上调又可以活化其他炎症细胞因子形成正反馈调节，最终导致炎症的泛化[14-15]。NF-κB这个信号通路已被较广泛的研究，NF-κB pP65蛋白由胞浆向胞核转移的核定位信号是NF-κB信号通路激活的关键点，该信号通路可调控上百个靶基因的转录，产生广泛的生物学效应[16-18]。为了研究NF-κB是否参与了MT-3调控的食管癌发病机制，本研究成功构建MT-3高表达和低表达的TE-1细胞系，检测pP65在其中的变化，发现MT-3高表达时，pP65明显增多，初步猜测NF-κB这个信号通路被激活，在TE-1中加入重组蛋白MT-3后发现pP65细胞入核明显，即肯定NF-κB这一信号通路是由于MT-3高表达而被激活。有研究显示，在肿瘤发生后，如果可以有效地控制炎症因子的释放，减轻炎症反应，将有可能阻止脊髓组织的进一步损伤，从而改善预后。笔者猜测MT-3的低表达可能会减轻食管癌患者的病情，当然这种猜测还需更进一步的研究证实。

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（张蕾 编辑）

MT-3 aggravates pathological process of esophageal cancer through activation of NF-κB signaling passway

Hai-jun Wang1,Xin Lu2,Yan-fen Zhang1,Ju-liang Liu1,Yong-qiang Han1
(1.Department of Thoracic Surgery;2.Department of Hematology,Xingtai Pepole's Hospital of Hebei Medical University,Xingtai,Hebei 054001,China)

Objective To research the development mechanism of esophageal cancer.Methods Ninety-two cases of esophageal cancer patients treated in Xingtai Pepole's Hospital of Hebei Medical University from July 2009 to February 2011 were selected for the study.MT-3 expression was detected in esophageal cancer tissues and the peri-cancerous tissues.MT-3 overexpression and low-expression cell lines were constructed.The activation state of NF-κB signaling pathway was checked at different levels of MT-3 expression.Then the expressions of P65 and pP65 were tested by Western blot.Immunofluorescence was used to further test whether pP65 was expressed in the nuclei when MT-3 was over-expressed.Results The expression of MT-3 in the tumor tissues was higher than that in the adjacent tissues(P=0.001).A high MT-3 expression esophageal cancer cell line and a low MT-3 expression cell line were successfully constructed.pP65 protein expression was enhanced when MT-3 was over-expressed,but decreased at low MT-3 expression;in contrast,P65 showed the opposite results with significant differences,which

MT-3;NF-κB;esophageal cancer

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.005

1005-8982（2016）22-0023-05

2016-04-06

suggested NF-κB signal was activated when MT-3 was over expressed.Immunofluorescence revealed that in MT-3 overexpression cells,more pP65 was expressed in the nuclei,which further supported that MT-3 activated NF-κB signaling pathway.Conclusions MT-3 suppresses the pathological process of esophageal cancer through activation of NF-κB signals.