特早熟春性甘蓝型油菜sBnFLD基因的克隆及表达

罗玉秀，张生萍，许唱唱，马小岗，杜德志

(青海大学 a 生态环境工程学院，b 农林科学院,青海 西宁 810016)



特早熟春性甘蓝型油菜sBnFLD基因的克隆及表达

罗玉秀a，张生萍a，许唱唱a，马小岗b，杜德志b

(青海大学 a 生态环境工程学院，b 农林科学院,青海 西宁 810016)

【目的】 克隆特早熟春性甘蓝型油菜A基因组上的sBnFLD基因，并对其进行表达研究，为该基因的功能及其在成花转变中的作用研究奠定基础。【方法】 根据GenBank中已报道的拟南芥和白菜型油菜FLD同源基因的保守序列设计引物, 采用PCR和RT-PCR 扩增特早熟春性甘蓝型油菜86号品系(光周期不敏感)的FLD同源基因，用qRT-PCR技术检测sBnFLD基因在86号品系不同发育时期茎、叶和茎尖中的表达情况。【结果】 克隆出了sBnFLD基因，命名为sBnFLD,在GenBank中的登录号为KR003079.1。sBnFLD基因cDNA 全长2 376 bp，有3个内含子，4个外显子，编码791个氨基酸残基，分子量86.5 ku，等电点8.5；sBnFLD为非分泌蛋白和非膜蛋白；sBnFLD蛋白N端有2个保守的结构域 α螺旋结构域(SWIRM)和NAD(P)-binding-8结构域，该蛋白有多个α螺旋和β折叠。生物信息学分析显示,sBnFLD蛋白与已报道的甘蓝型油菜未知蛋白(CDX73929.1)和电子克隆的白菜型油菜FLD(XP_009135110.1)氨基酸序列相似性达99%, 与拟南芥FLD氨基酸序列相似性达87%。qRT-PCR分析结果显示，sBnFLD基因在油菜苗期和现蕾初期茎、叶、茎尖中均有表达，但在蕾期茎尖中表达量最高。【结论】 克隆出的sBnFLD基因为甘蓝型油菜的FLD同源基因，该基因在春性特早熟甘蓝型油菜开花调控中可能起着重要的调节作用。

春性甘蓝型油菜；基因克隆；FLD同源基因；开花时间

开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要发育过程。模式植物拟南芥的研究表明，植物开花是在4种途径(光周期途径、自主途径、春化途径和赤霉素途径)内源和外源信号同时诱导下，多个特异性基因在时间和空间上顺序表达的结果[1]。拟南芥中开花相关的80多个基因已被克隆[2-3]。光周期途径中，昼夜节律基因收到光受体传来的信号后开始表达，表达产物通过激活或抑制光周期基因constans(CO)调控成花基因Flowering locus T (FT)和suppressor ofoverexpression of constans(SOCI)的表达，进而启动花分生组织特异基因LFY和AP1的表达,结果促使拟南芥开花[3]。春化途径中，低温诱导vernalizaion(VRN)基因表达，其表达产物抑制FLC基因，从而上调SOCI和FT基因在叶片中的表达, 结果促进开花[4]。EMF是主要的开花抑制基因，EMF的抑制作用随着植物发育进程逐渐降低，当降低到一定程度时茎端分生组织开始分化为花序分生组织，然后成花[5]。赤霉素在非诱导短日照下促进开花。自主开花途径能够通过感受植物内部的发育状态，依靠体内各基因间的相互拮抗和协同作用而使植物到达一定生长阶段后开花，是对光周期和春化都不敏感的开花途径[6-7]。目前，自主途径相关的6个基因FVE、FCA、FPA、FLD、LD和FY在拟南芥中都已被克隆，这些基因可能参与染色质转录后修饰，通过抑制FLC基因的表达促进开花[8-10]。尽管自主途径在拟南芥中研究很多，但在油料作物油菜中的研究还处于起步阶段。

拟南芥FLD基因是自主开花途径的重要基因之一，该基因在拟南芥中已经被分离出来，FLD基因含有2个外显子，编码789个氨基酸的表观遗传因子，对FLC染色质进行后期修饰[10]。拟南芥FLD-5突变体具有莲座叶，开花时间明显延迟等表型，可能特异性地与细胞分裂素和生长素的信号转导有关[4]。白菜型油菜FLD同源基因仅见电子克隆序列,而甘蓝型油菜FLD同源基因的克隆、生物信息学分析以及表达模式研究尚未见报道。为此，本研究以甘白杂交获得的特早熟春性甘蓝型油菜86号为材料，根据GenBank中已报道的拟南芥FLD基因和芸薹属植物FLD同源基因EST序列设计引物，采用同源克隆和RT-PCR相结合的方法，分离春性甘蓝型油菜FLD同源基因(springB.napusFLD,sBnFLD)，探讨其时空表达模式，为进一步研究该基因的功能及其在成花转变中的作用奠定基础，为筛选、培育早熟油菜新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

研究材料为春性甘蓝型油菜与青藏高原白菜型油菜种间杂交获得的86号品系，其表现特早熟，对光周期和春化不敏感[11]，由青海大学农林科学院春油菜研究中心提供。大肠杆菌菌株DH5α、克隆载体pMD18-T、各种内切酶、T4连接酶、各试剂盒，均购自TaKaRa(大连)公司。所用引物自行设计并由上海生工合成。

选取籽粒饱满的种子种植于人工气候箱中，设置温度为22 ℃/18 ℃(昼/夜)，16 h光照/8 h黑暗，光照强度350 μmol/(m2·s)，相对湿度为60%。1周浇1次水。苗期(两叶一心)和蕾期(现蕾初期)取茎、叶和茎尖组织液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2 方 法

1.2.1 总 RNA 的提取和反转录 采用TaKaRa公司的RNAiso Reagent试剂盒说明提取油菜幼嫩叶片的总RNA，电泳检测后按照First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明合成cDNA第一链，置-20 ℃冰箱备用。反转录条件：将1 μL总RNA，2 μL Oligo(dT)18和24 μL RNA free ddH2O混匀，65 ℃水浴5 min,冰浴30 s，瞬时离心，然后依次加入8 μL 5×Buffer,2 μL RNA inhibitor，4 μL dNTPs和2 μL M-MVLV，瞬时离心后在PCR仪上42 ℃孵育60 min,70 ℃灭火10 min。将合成的cDNA置-20 ℃冰箱备用。

1.2.2sBnFLD基因的克隆 (1)sBnFLD基因DNA序列克隆。根据 GenBank数据库中已报道的拟南芥FLD基因(GenBank 登录号为AY849996.1和AY849997.1)的核苷酸序列和白菜型油菜FLD同源基因电子克隆序列的保守序列设计引物(表1)，以基因组DNA为模板扩增sBnFLD基因的DNA序列。PCR反应体系为：DNA模板2 μL，10×Buffer 1.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 pmol/L的上下游引物各0.3 μL，rTaq0.2 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物，与载体 pMD18-T连接、转化大肠杆菌感受态细胞DH5α并过夜培养，蓝白斑筛选后挑取白斑进行菌液培养，将鉴定正确的阳性克隆菌液送上海生工测序。

表 1 本研究所用引物序列

(2)sBnFLD基因cDNA序列克隆。根据 GenBank数据库中已报道的拟南芥FLD基因(AY849996.1 )的编码区、分离出的sBnFLD基因组DNA序列以及芸薹属植物FLD基因的EST序列设计引物(表1)，以86号品系蕾期叶片RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行RT-PCR扩增，获得的片段测序后与GenBank中已公布芸薹属植物FLD同源基因的EST进行拼接。用TaKaRa公司的RACE试剂盒进行3′和5′RACE扩增，获得cDNA全长序列。反应体系为10 μL：包括cDNA模板2 μL，10×Buffer 1.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 pmol/L的上下游引物各0.3 μL，rTaq0.2 μL，ddH2O 4.8 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物的回收、连接、转化、鉴定、测序等步骤同(1)。

1.2.3sBnFLD基因及编码蛋白特征分析 将获得的sBnFLD基因在NCBI网站上进行 Blast比对，用ORF Finder 寻找开放阅读框；利用 DNAStar 软件进行多重序列比较和氨基酸同源性分析, 产生的多重比对结果通过 MEGA4.0 软件构建系统发育树；利用在线工具 TMHMM 和 SignalP 分析蛋白跨膜结构域和预测信号肽; 利用 ExPASy 工具中的 SOPMA 软件预测蛋白质二级结构。用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)在线对三级结构进行预测。

1.2.4sBnFLD基因的表达 分别提取苗期(两叶一心)和蕾期(现蕾初期)茎、叶和茎尖组织的总RNA，并用RNase-free DNaseⅠ(Promega，USA) 消化处理。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。用分光光度计检测 RNA 纯度。按First-Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)试剂盒说明合成cDNA第一链，以反转录的双链cDNA为模板，根据分离出的sBnFLD基因cDNA保守序列设计特异引物(表1)，以β-actin基因(GenBank登录号AF11812)为内参，用qRT-PCR技术检测sBnFLD在花芽分化过程中不同组织(茎、叶和茎尖)的表达水平。具体步骤按TaKaRa一步法荧光定量试剂盒说明进行。β-actin引物见表1。PCR反应体系为10 μL，包括cDNA模板2 μL，10×Buffer 1.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 pmol/L的上下游引物各0.3 μL，rTaq0.2 μL，ddH2O 4.8 μL。PCR反应条件为,94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1sBnFLD基因分离及序列分析

以油菜基因组DNA为模板，用设计的基因组DNA扩增引物分离出FLD同源基因的DNA片段(图1)，经拼接后获得2 876 bp的片段，命名为sBnFLD，在GenBank登录号为KR003079.1。以cDNA为模板，用扩增sBnFLD基因cDNA的引物进行RT-PCR扩增(图1)，扩增产物经克隆测序后与FLD同源基因的EST序列拼接， 获得了2 376 bp的cDNA全长序列。sBnFLD基因组DNA序列与cDNA序列比对结果表明，该基因有4个外显子，3个内含子。第1个内含子长83 bp,第2和第3个内含子长80 bp。第1个外显子最长(1 543 bp)，最后一个外显子最短(28 bp)。扩增出的sBnFLD基因与GenBank中公布的拟南芥FLD基因(AY849996.1和AY849997.1)相似性达83%。拟南芥FLD基因只有1个内含子，其内含子两侧的编码序列与sBnFLD基因的第一个内含子两侧序列完全一致，但这2个内含子长度不同，序列也没有同源性。其他植物中未见FLD同源基因DNA序列及其内含子的报道。sBnFLD基因与GenBank中已公布的盐生植物山萮菜FLD同源基因(XM_006407512.1)、拟南芥赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1基因(NM_111874.4)、桃树假蛋白基因(XM_007220197.1)、大豆FLD同源基因(EU857407.1)、豌豆FLD同源基因(AY830930.1)和玉米FLD同源基因(NM_001154598.1)相似性分别为87%,85%，75%，75%，77%和69%。说明分离出的sBnFLD是春性甘蓝型油菜的FLD同源基因。

M.DNA分子量标记DL2000；1～4.用引物FLD-3F/FLD-3R扩增的PCR产物；5～8.用cFLD-2F/cFLD-2R扩增的PCR产物；9～15.用cFLD-1F/cFLD-1R扩增的PCR产物

2.2sBnFLD基因氨基酸序列分析

经ORF Finder 及GENSCAN 预测，sBnFLD基因的CDS区长2 376 bp，编码791个氨基酸，分子量为86.5 ku，等电点为8.5，命名为sBnFLD。通过SignalP4.0预测结构表明，sBnFLD为非分泌蛋白。TMHMM跨膜预测结果表明，sBnFLD为非膜蛋白。sBnFLD蛋白二级结构分析发现，该蛋白N端有两个保守的结构域，其中一个是由85个氨基酸残基组成的α螺旋结构域(SWIRM)，位于第60-146个氨基酸，参与蛋白质互作，很多与染色体相互作用的蛋白都含有SWIRM结构域；另一个是NAD(P)-binding-8结构域，此结构域为氨基酸脱氢酶的辅酶结合域，位于第170-233个氨基酸。用SWISS-MODEL网上在线预测了sBnFLD的三级结构，结果显示该蛋白有多个α螺旋和β折叠(图2)。

图 2 sBnFLD蛋白三级结构

氨基酸相似性比较发现，sBnFLD蛋白的氨基酸序列与NCBI中已公布的甘蓝型油菜A03染色体上的未知基因(CDX73929.1)和白菜型油菜电子克隆的FLD基因编码的蛋白(XP_009135110.1)序列相似性很高，与甘蓝型油菜另一个未知功能蛋白(CDY00667.1)的相似性达98%，与拟南芥FLD蛋白(AAX51267.1)相似性达87%，与芝麻、番茄、野草莓、巨桉和烟草的FLD同源蛋白的相似性为75%～86%。证明克隆的sBnFLD基因编码的蛋白是FLD同源蛋白。说明克隆的sBnFLD基因来源于白菜型油菜A03。进一步分析特早熟春性甘蓝型油菜与其他植物预测的FLD蛋白的亲缘关系，将不同植物的FLD蛋白氨基酸预测序列进行系统发生分析，结果如图3所示。由图3可见，特早熟春性甘蓝型油菜的 sBnFLD蛋白与芸薹属属于同一亚族，比十字花科其他植物亲缘关系更近，与芝麻亲缘关系最远。

图 3 sBnFLD氨基酸序列聚类分析

2.3sBnFLD基因在油菜不同组织中的表达

qRT-PCR分析结果(图4)表明，sBnFLD基因在苗期及现蕾初期茎、叶和茎尖中均有表达。苗期茎尖中表达量最低，茎中表达量最高；现蕾初期叶片中表达量最低，茎尖中表达量最高。从苗期到现蕾初期的过渡中，茎和叶中的表达量降低，而茎尖中的表达量激增。说明sBnFLD基因在开花控制中起重要作用。

图 4 sBnFLD基因在油菜不同组织中的相对表达量

3 讨 论

FLD基因是拟南芥中分离出的自主开花途径的重要基因，其他植物中对FLD同源基因的克隆及表达方面的研究很少[12-14]。本研究采用同源克隆技术，以特早熟甘蓝型油菜86号品系为研究材料，分离出了春性甘蓝型油菜sBnFLD基因的基因组DNA和cDNA全长序列，并且确定了其内含子和外显子序列。已公布的拟南芥FLD基因只有一个内含子，该内含子与克隆的sBnFLD基因的第一个内含子序列没有同源性，但他们的两侧编码序列相同。

氨基酸序列分析结果表明，克隆的春性甘蓝型油菜sBnFLD基因的cDNA具有完整的编码框，所编码的蛋白与GenBank中公布的拟南芥FLD、甘蓝型油菜未知功能蛋白(CDX73929.1)以及电子克隆的白菜型油菜FLD同源蛋白(XP_009135110.1)具有极高的相似性，证明了所克隆基因的准确性。GenBank中注册的未知蛋白XP_009135110.1可能为甘蓝型油菜FLD同源蛋白。

开花机理的研究结果表明，自主开花基因编码调节蛋白[15-20]。拟南芥FLD基因编码一个与人的组蛋白赖氨酸去甲基化酶1(LSD1)同源的蛋白，参与组蛋白的去甲基化和去乙酰化，通过抑制FLC基因促进开花[21-22]。本研究克隆的sBnFLD蛋白含有一个α螺旋结构域(SWIRM)，含有SWIRM结构域的蛋白参加蛋白互作，很多与染色体相互作用的蛋白都含有SWIRM结构域，是LSD1家族的成员[23]。然而，除了SWIRM结构域外，sBnFLD蛋白还含有一个拟南芥FLD中所没有的NAD(P)-binding-8结构域。NAD(P)-binding Rossmann-like domain结构域有一个α-β-α螺旋结构，隶属于Rossmann折叠大家族的成员，作用原理是以辅酶DND(P)作为辅助因子，催化氨基酸脱氢形成酮酸。

自主开花途径基因(FVE、FCA、FPA、FLD、LD和FY)的表达不依赖环境条件，彼此之间互不调控基因mRNA水平的表达，在植物的各个器官中平行表达[17,19,24-25]。FLD基因在拟南芥几乎所有组织中表达，但在茎尖中的表达水平最高[26]。大豆GmFLD基因转录产物在大豆所有组织中都能检测到，但该基因在真叶和茎尖中的表达量非常低[12]。春性特早熟甘蓝型油菜sBnFLD基因在油菜各器官中均有表达，但在蕾期茎尖中的表达量最高。这与拟南芥中的研究报道一致。说明sBnFLD基因在特早熟春性甘蓝型油菜开花调控中起着十分重要的作用。通过对春性甘蓝型油菜自主开花途径重要基因sBnFLD的研究，有助于理解其在植物开花乃至其生长发育中的作用，为阐明植物开花分子机制提供理论依据。

4 结 论

开花在高等植物中是一个重要的生理过程，从春性特早熟甘蓝型油菜86号品系中分离出的sBnFLD基因是拟南芥FLD同源基因，sBnFLD基因cDNA全长2 376 bp，编码由791个氨基酸残基组成的蛋白。该基因可能通过染色质修饰对油菜开花起着重要的调节作用。

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Cloning and expression ofsBnFLDgene from spring rapeseed (BrassicanapusL.)

LUO Yuxiua,ZHANG Shengpinga,XU Changchanga,MA Xiaogangb,DU Dezhib

(aCollegeofEco-EnvironmentalEngineering,bQinghaiAcademyofAgricultureandForestry,QinghaiUniversity,Qinghai,Xining810016,China)

【Objective】 The research clonedsBnFLDgene and analyzed its expression.【Method】 The primers were designed according to conversed sequence of publishedFLDinArabidopsisandB.rapa.Homologues cloning and reverse transcription PCR (RT-PCR) were applied to clone the gene and analyze its expression.【Result】 TheFLDhomologue gene was cloned inB.napusand namedsBnFLD(accession No.KR003079.1).The CDS sequence ofsBnFLDwas 2 376 bp,containing 3 introns and 4 exons,and encoding a protein of 791 amino acid residues with a predicted molecular weight of 86.5 ku and a theoretical pI of 8.5.sBnFLD was nerther secreted protein nor non-membrane protein.N-terminal of sBnFLD had two conserved domains,SWIRM and NAD(P)-binding-8.sBnFLD is a instability protein composed with alpha helix and beta folding.Bioinformatics analysis showed that the sBnFLD had 99% similarity with unknown protein CDX73929.1 inB.napusand prediction protein XP_009135110.1 inB.rapa,and had 87% similarity with FLD inA.thaliana.The expression analysis ofsBnFLDgene using qRT-PCR showed that thesBnFLDgene was expression in stem,seeding and shoot tips at seeding and bud stage.However,the relative expression level of the gene was the highest in shoot tips at bud stage.【Conclusion】 As homologous gene ofFLD,sBnFLDmight play a role in flowering regulation.

spring rape (BrassicanapusL.);gene cloning;FLDhomologue;flowering time

时间:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.013

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.026.html

2015-05-14

国家自然科学基金项目(31360345)；青海省科技厅项目(2016-ZJ-787)；国家“863计划”项目(2011AA10A104)；科技部科技支撑计划项目(2013BAD01B05-3)

罗玉秀(1969-)，女，青海民和人，教授，博士，主要从事油菜遗传育种研究。E-mail:lyxiu2@163.com

杜德志(1964-)，男，江西吉安人，研究员，博士生导师，主要从事油菜遗传育种研究。

S565.4

A

1671-9387(2016)11-0090-07