芍药苷对大鼠皮质酮损伤的海马神经元TrkB/BDNF信号通路的影响

董海影 张 春 弓 箭 张晓杰 李春旭

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)



芍药苷对大鼠皮质酮损伤的海马神经元TrkB/BDNF信号通路的影响

董海影 张 春1弓 箭 张晓杰 李春旭

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 观察芍药苷对皮质酮诱导海马神经元损伤的影响。方法 体外培养新生SD大鼠海马神经元，采用皮质酮诱导原代培养海马神经元建立皮质酮损伤模型。培养体系中加入不同浓度的芍药苷进行预处理。采用WST-1法检测芍药苷对神经元存活率的影响，应用PCR与Western印迹检测神经元脑源性神经营养因子(BDNF)与酪氨酸激酶受体B(TrkB)的表达。结果 与皮质酮组相比，中高剂量芍药苷可明显增加海马神经元活力(P<0.05)，可明显增加海马神经元TrkB与BDNF的 mRNA与蛋白表达水平(P<0.05)。结论 芍药苷对皮质酮诱导的原代培养海马神经元损伤具有保护作用，具有抗抑郁作用。

芍药苷；海马神经元；TrkB/BDNF

芍药具有养血调经、柔肝止痛、平抑肝阳等功效，主要有效成分为芍药苷〔1〕，具有显著的抗抑郁样活性〔2〕。本实验主要研究芍药苷对皮质酮诱导海马神经元损伤和脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸激酶受体B(TrkB)表达的影响，进而探讨芍药苷抗抑郁的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及动物 芍药苷标准品(CAS：23180-57-6)；细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒(Beyotime公司，P20028)；TRIzon Reagent 总RNA提取试剂盒，Prime ScriptTMRT reagent Kit(TaRaKa，cat：RR370A)，SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，cat：RR420A)。原代海马神经元源于新生24 h的SD大鼠的乳鼠，清洁级，雌雄不限。

1.2 方法

1.2.1 海马神经元的原代培养 选取新生24 h内的SD大鼠的乳鼠，将其置于无菌环境下，借助于解剖显微镜取出海马，将收集的海马组织修剪为约1 mm3，置于预冷的HBSS培养皿中，加入预热的0.25%EDTA-胰蛋白酶溶液，在37℃水浴条件下消化15 min；应用牛血清终止反应后弃掉上清液，应用HBSS洗涤；加入种植液，吸取上清液置于离心管中，细胞浓度调整为(0.5～1)×107个/ml，接种于6孔板、24孔板和96孔板；待24 h贴壁后换为饲养液，抑制胶质细胞生长，7 d用于实验。

1.2.2 海马神经元的鉴定 应用Nissl染色方法进行鉴定。将细胞接种于6孔板，采用4%多聚甲醛固定，Nissl染色，蒸馏水和乙醇洗涤，倒置显微镜下观察。

1.2.3 神经元分组 原代神经元培养第7天后，分为空白对照组，皮质酮组(200 μmol/L)，芍药苷组(0.1、1、10 μmol/L)。芍药苷各组先加入芍药苷预处理48 h后，再加入皮质酮损伤神经元共孵育24 h。

1.2.4 WST-1检测海马神经元增殖活性 海马神经元培养于96孔板，然后孔内加入10 μl WST-1工作液，在5%CO2、37℃的条件下培养4 h，检测OD值。

1.2.5 PCR检测海马神经元TrkB与BDNF的mRNA表达 首先采用光度计和凝胶电泳对提取的RNA进行纯度、浓度和完整性检测；然后借助Prime ScriptTMRT reagent Kit 反转录反应试剂盒进行逆转录反应。反应参数：反转录反应42℃ 15 min，反转录酶失活反应85℃ 5 s。PCR反应引物由TaKaRa 公司设计合成，序列如下：TrkB正义：5＇-GGGGCTTATGCTTGCTGGTC-3＇；反义：5＇-CTCTGGGTCATTGCTGTTAGGTT-3＇；BDNF正义：5＇-CCCTTCTACACTTTACCTCTT-3＇；反义：5＇-GTTTCACCCTTTCCACTCCTA-3＇。

1.2.6 Western印迹检测TrkB与BDNF蛋白水平的表达 电泳分离蛋白，转膜，封闭，加抗，曝光。最后应用ImageJ2x分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，以目的基因条带与内参基因GAPDH的比值表示蛋白的表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1 各组海马神经元WST-1检测结果 与空白对照组(1.308±0.081)比较，皮质酮组细胞活力(0.688±0.059)明显降低(P<0.05)；与皮质酮组比较，芍药苷0.1 μmol/L组(0.597±0.101)无明显差异(P>0.05)，芍药苷1 μmol/L组(1.323±0.978)与芍药苷10 μmol/L组(1.319±0.130)的细胞活力明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，且二者相比无明显差异(P>0.05)。

2.2 各组海马神经元TrkB与BDNF mRNA检测结果 与空白对照组比较，皮质酮组TrkB与BDNF mRNA表达均明显降低(P<0.05)；而与皮质酮组相比，芍药苷0.1 μmol/L组无明显差异(P>0.05)，芍药苷1 μmol/L组与芍药苷10 μmol/L组的TrkB与BDNF mRNA表达水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 各组海马神经元TrkB与BDNF蛋白水平检测 与空白对照组比较，皮质酮组TrkB与BDNF 蛋白表达均明显降低(P<0.05)；而与皮质酮组相比，芍药苷0.1 μmol/L组无明显差异(P>0.05)，芍药苷1 μmol/L组与芍药苷10 μmol/L组的TrkB与BDNF蛋白表达水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1。

表1 各组海马神经元TrkB与BDNF mRNA表达的比较

与空白对照组比较：1)P<0.05；与皮质酮组比较：2)P<0.05；下表同

表2 各组海马神经元TrkB与BDNF 蛋白表达的比较

A：空白对照组；B：皮质酮组；C：芍药苷0.1 μmol/L组；D：芍药苷1 μmol/L组；E：芍药苷10 μmol/L组图1 TrkB与BDNF的Western印迹检测结果

3 讨 论

芍药苷是提取于芍药中的中药单体，是芍药的主要活性成分，不仅具有抗炎、抗过敏、改善认知能力和改善血循环等多种药理作用，还具有抗抑郁样活性〔3〕。本课题组在前期实验过程中发现，芍药苷在抑郁症经典行为学实验中，能够显著缩短行为绝望模型小鼠悬尾不动时间，提示芍药苷具有一定的抗抑郁作用。神经病理学研究结果显示，抑郁症的发生发展与脑内重要边缘系统结构——海马区域神经细胞的萎缩和坏死有重要关系〔4〕。临床的影像学研究资料亦提示，与正常人的大脑海马体积相比，抑郁症患者海马体积明显缩小，且缩小程度与抑郁持续时间呈正相关〔5〕。诸多研究结果证实抑郁症的发病与海马结构关系密切。因此，如果能够激活海马区内源性神经前体细胞，进而促进成年脑神经元再生，将有可能是抑郁症治疗的一个突破性变革。BDNF作为神经生长因子家族中的重要成员，主要通过与神经元细胞膜表面受体 Trkb 结合，进而调控神经元的发育、分化、功能维持以及突触可塑性〔6〕。研究亦发现，如果增加BDNF及其受体TrkB的表达强度，进而增强其神经营养的作用、促进多种类型神经元的生长、发育、存活、分化和功能表达，同时也能维持中枢神经系统成熟神经元的正常功能，也是抗抑郁治疗的主要靶向之一〔7〕。

肝郁气滞证为中医证候最常见的证候类型，居各证之首，而柴胡疏肝散是临床上治疗抑郁症最常用的经典名方之一，临床及实验研究均显示该经典方剂具有确切的抗抑郁作用〔8，9〕。柴胡疏肝散中白芍与柴胡相伍一散一收，助柴胡疏肝，相反相成共为主药，而芍药苷是白芍的主要活性成分〔10〕。本文通过观察芍药苷对皮质酮诱导海马神经元损伤的影响，进一步探讨芍药苷抗抑郁症的作用机制。研究结果显示，芍药苷对皮质酮诱导的原代培养海马神经元损伤具有保护作用，增加神经元活力，还能够增加与神经元突触可塑性有关的TrkB和BDNF mRNA表达水平，说明芍药苷具有一定的抗抑郁作用。至于其抗抑郁症具体作用机制还有待以后进一步深入研究。

1 金树梅，苏文华，崔广智.芍药苷在药物诱发抑郁模型中的抗抑郁作用观察〔J〕.山东医药杂志，2013；53(19)：28-9.

2 Mao QQ，Ip SP，Tsai SH，etal.Antidepressant like effect of peony glycos ides in mice〔J〕.J Ethnopharmacol，2008；119(2)：272.

3 Chen T，Guo ZP，Jiao XY，etal.Peoniflorin suppresses tumor necrosis factor-α induced chemokine production in human dermal microvascular endothelial cells by blocking nuclear factor-κB and ERK pathway〔J〕.Arch Dermatol Res,2011；303(5)：351-60.

4 McEwen BS.Plasticity of the hippocampus：adaptation to chronic stress and allostatic load〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2001；933(3)：265-77.

5 Egger K，Schocke M，Weiss E，etal.Pattern of brain atrophy in elderly patients with depression revealed by voxel-based morphometry〔J〕.Psychiatry Res，2008；164(3)：237-44.

6 张子韬.BDNF信号通路调节神经元突触形成及递质释放的机制研究〔D〕.南京：南京医科大学，2013.

7 Costa MS，Botton PH，Mioranzza S，etal.Caffeine improves adult mice performance in the object recognition task and increases BDNF and TrkB independent on phospho-CREB immunocontent in the hippocampus〔J〕.Neurochem Int，2008；53(3-4)：89-94.

8 董海影，张晓杰.柴胡疏肝散对抑郁模型大鼠海马乙酰胆碱代谢的影响〔J〕.中华中医药杂志，2011；26(1)：163-7.

9 杨满菊.柴胡疏肝散改善帕金森病患者抑郁症状疗效评价〔J〕.光明中医,2010；25(1)：31-2.

10 李春香，丁里玉，丁 芳，等.白芍养血柔肝止痛作用与其配伍及芍药苷含量的相关性研究〔J〕.中药新药与临床药理，2011；22(1)：54-6.

〔2016-05-25修回〕

(编辑 曲 莉)

Effect of Paeoniflorin on the TrkB/BDNF signaling pathway of corticosterone-damaged hippocampal neurons

DONG Hai-Ying,ZHANG Chun,GONG Jian,et al.

Pathology Diagnosis Center of Qiqihar Medical College,Qiqihaer 161006,Heilongjiang,China

Objective To observe the effect of paeoniflorin on the damage of hippocampal neurons induced by corticosterone and investigate the mechanisms of paeoniflorin against depression.Methods Hippocampal neurons derived from newborn SD rats were cultured in vitro,using primary cultured hippocampal neurons induced by corticosterone to set up the corticosterone-injured model.The culture system was added to different concentrations of corticosterone pretreatment.WST-1 assay was used to detect the effect of paeoniflorin on the neuronal survival rate.The expression of TrkB/BDNF was detected by PCR technology.Results Compared with the model group,the medium and high dosage of corticosterone could significantly increase the hippocampal neuronal viability.The differences were significant(P<0.05).The medium and high dosage of corticosterone could obviously enhance the mRNA expression level of TrkB/BDNF(P<0.05).Conclusions Paeoniflorin has protective effect on corticosterone-induced primary cultured hippocampal neurons and antidepressant effect.

Paeoniflorin;Hippocampal neurons;TrkB/BDNF

国家自然科学基金项目(81173576)；黑龙江省卫生厅科研课题(2012-338)

李春旭(1965-)，男，硕士，副教授，主要从事临床病理学研究。

董海影(1982-)，女，博士，讲师，主要从事神经精神疾病的病理学研究。

R74

A

1005-9202(2016)22-5499-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.003

1 宁夏医科大学颅脑疾病重点实验室