疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇对乳腺癌大鼠乳房微循环的影响

王玉祥 杨 洁 杨 超 王少青 张 辛 宋玉芝

(河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011)



疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇对乳腺癌大鼠乳房微循环的影响

王玉祥 杨 洁 杨 超 王少青1张 辛 宋玉芝

(河北医科大学第四医院，河北 石家庄 050011)

目的 观察疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇对乳腺癌大鼠乳房微循环的影响。方法 将形成满意肿瘤结节的乳腺癌大鼠随机分为乳腺癌组、紫杉醇组、小剂量疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇组(小剂量联合组)和大剂量疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇组(大剂量联合组)，将同期健康大鼠作为对照组。给予紫杉醇组尾静脉注射紫杉醇(剂量25 μg/g)，小剂量联合组在紫杉醇组基础上给予10 ml/kg疏肝化痰祛瘀方汤剂灌胃，大剂量联合组在紫杉醇组基础上给予(20 ml/kg)疏肝化痰祛瘀方汤剂灌胃，对照组尾静脉及灌胃给予0.9%氯化钠溶液，所有组别连续给药4 w。检测体重、微循环灌注量、血液黏稠度和乳房组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)水平。结果 与对照组比较，乳腺癌组的体重与微循环灌注量明显降低(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明显增加(P<0.05)，与乳腺癌组比较，紫杉醇组、小剂量和大剂量联合组的体重与微循环灌注量显著增高(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明显降低(P<0.05)，与紫杉醇组比较，大剂量联合组的体重与微循环灌注量显著增高(P<0.05)，血液黏稠度、VEGF和bFGF水平明显降低(P<0.05)。结论 疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇对乳腺癌大鼠具有一定的治疗效果，与改善乳房微循环、血流黏稠度和乳腺组织的VEGF和bFGF表达有关。

疏肝化痰祛瘀方；紫杉醇；乳腺癌；乳房微循环

乳腺癌在中医领域属于“乳岩”的范畴，其病机在“瘀”和“痰”两方面〔1，2〕，其一：肝郁致使气机运行不畅，气机郁滞，气滞血瘀，其二，肝郁克脾，脾不健运，水湿聚而为痰。可见“瘀”和“痰”是乳腺癌的病理产物，可见消除病理产物可能是乳腺癌的治疗途径之一。疏肝化痰祛瘀方是临床治疗乳腺癌的常用方剂，也获得了较好的效果，但其治疗机制至今仍未有研究。本研究观察疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇对乳腺癌大鼠乳房微循环的影响。

1 资料与方法

1.1 受试动物 选择健康没有生育史的雌性SD大鼠，体重180～220 g，购于浙江省试验动物中心，生产许可证号：SCXK(浙)2003-0001。12 h日光灯照明，自由饮水摄食，常规饲养7 d后开始实验。

1.2 Walker-256肿瘤细胞 Walker-256肿瘤细胞购于美国ScienCell研究实验室，应用常规1640培养基培养，置于5%CO2培养箱37℃中培养。在指数增长期消化收集待用。

1.3 受试药品 紫杉醇购自美国Sigma公司，二甲基苯蒽(DMBA，Sigma公司，批号：087K1196，规格：5 g/瓶)；疏肝化痰祛瘀方：当归、川芎、青皮、醋制香附、桃仁、红花、浙贝母和白芥子各12 g、半夏和苍术各10 g，皂角刺20 g、陈皮6 g，加水1 L，煎至100 ml。疏肝化痰祛瘀方各味药均购自市中药材批发市场，由齐惠珍教授鉴别为真品。兔抗鼠VEGF抗体和和兔抗鼠bFGF抗体均购自美国Millipore公司。

1.4 试验仪器 IEC601-1型激光多普勒微循环分析仪及配套LAB Measurement Statistics软件系统(英国Moor公司)；FASCO型全自动血液流变快测仪(重庆大学维多研究所)；BX50-3E01型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；RM-2235型石蜡切片机(德国徕卡公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 乳腺癌大鼠的制备 参照相关文献〔3〕，构建乳腺癌大鼠模型。Walker-256肿瘤细胞单次接种在大鼠左侧腋下，将死亡或未形成满意肿瘤结节淘汰，成功率约60%。

1.5.2 分组和给药 将形成满意肿瘤结节的乳腺癌大鼠随机分为乳腺癌组，紫杉醇组，小剂量疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇组(小剂量联合组)和大剂量疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇组(大剂量联合组)，每组12只，将同期健康大鼠作为对照组。给予紫杉醇组尾静脉注射紫杉醇(剂量25 μg/g)，小剂量联合组在紫杉醇组基础上每日给予疏肝化痰祛瘀方汤剂按鼠体重10 ml/kg灌胃2次，每12 h灌胃1次；大剂量联合组每日给予疏肝化痰祛瘀方汤剂按鼠体重20 ml/kg灌胃2次，每12 h灌胃1次。对照组给予尾静脉及灌胃注射0.9%氯化钠溶液，所有组别连续给药4 w。

1.5.3 指标检测

1.5.3.1 乳房微循环灌注量 给药结束前1 d，除去大鼠胸部鼠毛，第二天，麻醉大鼠，激光探头置于大鼠腋前第5对乳房，测试大鼠乳腺微循环的灌注量。

1.5.3.2 血液流变学 取大鼠下腔静脉血5 ml静脉血，注入肝素抗凝，检测血液流变学参数。

1.5.3.3 乳房组织中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)水平 给药结束后，处死大鼠，在无菌条件下，取大鼠胸部左侧第2只乳腺和周围皮肤约1.5 cm×1.5 cm，用甲醛固定，石蜡包埋，切片。石蜡切片水化，用PBS液冲洗，切片加过氧化氢溶液孵育10 min，PBS冲，加EDTA高压热修复2 min，切片再加—抗，室温孵育60 min，PBS 冲洗，切片再加聚合物增强剂，室温下孵育，PBS 冲洗，加50酶标鼠/兔聚合物，室温孵育，PBS 冲洗，再加DAB显色液，阴性对照采用PBS液代替一抗，镜下观察，阳性显色为棕色。用尼康NIS-Element BR3.1图像分析系统，每份样本随机选5个视野，将视野中的阳性细胞面积与总面积的比值作为VEGF和bFGF的表达量。

1.6 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行Mann-WhitneyU检验或Fisher精确检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠的一般情况比较 乳腺癌组大鼠反应迟缓、皮毛松弛，暗淡无光、蜷缩少动、对刺激敏感度降低和饮食水量减少。紫杉醇组皮毛松弛，毛发暗淡、倦怠淡漠、对刺激敏感度降低。小剂量和大剂量联合组趋向正常。实验中乳腺癌组大鼠死亡3只，紫杉醇组死亡2只，大剂量联合组死亡1只，小剂量联合组死亡2只。

2.2 各组大鼠的肿瘤发生比较 与对照组比较，乳腺癌组的肿瘤个数明显增高(P<0.05)，与乳腺癌组比较，紫杉醇组、小剂量和大剂量联合组的肿瘤个数显著降低(P<0.05)。见表1。

2.3 各组大鼠的体重和乳房微循环灌注量的比较 与对照组比较，乳腺癌组的体重与微循环灌注量明显降低(P<0.05)，与乳腺癌组比较，紫杉醇组、小剂量和大剂量联合组的体重与微循环灌注量显著增高(P<0.05)，与紫杉醇组比较，大剂量联合组的体重与微循环灌注量显著增高(P<0.05)，见表2。

2.4 各组大鼠的血液流变学参数的比较 与对照组比较，乳腺癌组的血液黏稠度明显增加(P<0.05)，与乳腺癌组比较，紫杉醇组、小剂量联合组和大剂量联合组的血液黏稠度明显降低(P<0.05)，与紫杉醇组比较，大剂量联合组的血液黏稠度显著降低(P<0.05)，见表3。

表1 各组大鼠的肿瘤发生比较

与对照组比较：1)P<0.05；与乳腺癌组比较：2)P<0.05

表2 各组大鼠的体重乳房微循环灌注量的比较±s)

与对照组比较：1)P<0.05;与乳腺癌组比较：2)P<0.05;与紫杉醇组比较：3)P<0.05，下表同

表3 各组大鼠血液流变学参数的对比±s,mPa·s)

2.5 各组大鼠乳腺组织VEGF和bFGF水平的比较 与对照组比较，乳腺癌组的VEGF和bFGF水平显著增高(P<0.05)，与乳腺癌组比较，紫杉醇组、小剂量联合组和大剂量联合组的VEGF和bFGF显著降低(P<0.05)，与紫杉醇组比较，大剂量联合组的VEGF和bFGF显著降低(P<0.05)，见表4。

表4 各组大鼠乳腺组织VEGF和bFGF水平的比较±s，阳性细胞面积/总面积)

3 讨 论

乳腺癌发病因素复杂，确切病因未知，但目前多认为其是环境和遗传因素等多种因素，如遗传，绝经年龄，内分泌，月经情况，生育情况，性生活，吸烟饮食等多种因素共同作用导致。在乳腺癌的治疗中，手术治疗仍是最主要的手段，临床中多采用手术为主辅助放化疗及其他内分泌治疗的模式。然后多种治疗方法均存在弊端及多种并发症及毒副作用，在这种情况下，中医治疗以其独特的优势得以体现。

从中医学理论看，肝主疏泄、主藏血，可调畅气机，促进气血运行，脾主运化水湿，水为生痰之源。乳腺癌的病机在于肝疏泄功能失调，气机郁滞，影响气血运行，气行则血行，气滞则血瘀，形成瘀血证；肝木乘脾，水湿不运，积而成痰；肝失疏泄，气机阻滞，水湿气化蒸腾障碍，津液输布受阻成痰成饮，肝气郁滞，痰瘀乃成。痰瘀既成又互相转化，互为因果，痰积日久，阻遏气机运行，可加重瘀血，二者交错互阻致瘀滞，痰和瘀需联合治之，治痰则瘀不去，逐瘀则痰不消。疏肝化痰祛瘀方中的青皮和香附具有疏肝行气之效，当归、川芎、桃仁、红花和穿山甲皆有活血化瘀功效，三棱、莪术、皂角刺与路路通行气活血，备穿透之力，辅以半夏、浙贝母、白芥子和海藻辅助化痰软坚散结，诸药合用，可达治痰去瘀和气畅痰消之功〔4～6〕。本研究结果显示，疏肝化痰祛瘀方可明显改善乳腺癌大鼠的反应，皮毛的光泽度和饮食饮水量，提示疏肝化痰祛瘀方可调节乳腺癌所致的肝血不畅，水湿停滞和痰瘀阻滞，在改善乳腺癌的临床症状具有明显的优势。

乳腺组织微循环障碍是乳腺癌病变的集中体现，多种因素均可以导致乳腺组织微循环障碍，研究表明〔7〕与以下因素有关：①从血流动力学范畴看，血液黏稠度的增加可导致循环阻力的增高。本文结果证明乳腺癌大鼠乳腺的血液黏稠度均明显增高，而给予干预后大鼠乳腺的血液黏稠度指标均明显降低。②从分子生物学角度看，乳腺组织VEGF和bFGF表达增加可加重乳腺组织微循环障碍。病理条件下，VEGF常呈现异常表达，肿瘤细胞可刺激 VEGF 表达上调，上调的VEGF可与其受体作用使肿瘤血管内皮细胞异常增殖、迁移，促进新生血管形成，同时血管通透性的增加，为肿瘤生长、侵袭和转提供营养。肿瘤细胞可诱导血管内皮细胞产生 bFGF 作为血管诱生剂，bFGF 在乳腺组织中阳性表达率超过68%。VEGF 与bFGF两者在血管生成中呈协同作用：VEGF及VEGF受体表达受到 bFGF 调控，bFGF可诱导 VEGF 的合成，还可上调VEGF 受体 FLK-1表达。肿瘤必须构建自己的血管系统，通过新生血管提供氧气、养料并及时清除代谢产物才能够持续性生长和发展。如果没有血管系统提供氧气和养料，实体瘤的体积增长难以超过1 mm3〔8〕。可见VEGF 与bFGF的表达水平与肿瘤恶性程度及预后紧密相关。本文结果显示，给予乳腺癌大鼠以疏肝化痰祛瘀方可明显改善乳腺组织的微循环，可能与降低血液高黏状态和降低乳腺组织VEGF和bFGF表达相关，这两种作用应与疏肝化痰祛瘀方的组成密切相关：①疏肝化痰祛瘀方具有化痰祛瘀和通窍止痛的功效，可明显改善偏头痛患者的血液流变学指标〔9〕；②祛瘀化痰法具有抗肺癌转移的作用，其机制在于影响肺癌细胞的VEGF和CD44等蛋白合成和基因转录水平的表达，影响肿瘤血管的生成，达到影响肿瘤细胞增殖、黏附、迁移和侵袭的目的〔10〕。桃仁和红花作为破血药，体外试验显示破血药可降低VEGF和bFGF蛋白表达〔11〕，川芎中的川芎嗪可通过降低VEGF和bFGF表达抑制胃癌新生血管生成〔12〕。目前对桃仁调节VEGF表达的趋向仍存在争议，如以敏〔13〕研究认为桃仁可以降低VEGF表达，但只能降低热证的VEGF，不能降低寒证的VEGF，原因不明，而乳腺癌患者以寒证明显〔14〕，如果该研究结果确凿，那么桃仁升高乳腺癌组织VEGF作用可能被红花和川芎的作用所掩盖了。

本文的不足处：①疏肝化痰祛瘀方的有效成分比较复杂，包含了当归、川芎和青皮等12味药，药物来源不同，煎煮时间，煎煮温度和器皿等不同均可不同程度影响疗效，因此难以进行质量控制和商品化，一定程度地抑制了该方的标准化开发；②疏肝化痰祛瘀方中的当归和川芎不仅是活血的主要成分，而且具有补血的效果，疏肝化痰祛瘀方两者比例为1∶1，有研究〔15〕认为两者比例1∶1.5在补血方面具有明显的效果，疏肝化痰祛瘀方的活血药物较多，因此活血功效明显，补血相对不足，是否有必要调整当归和川芎比例，还有待于进一步的考察；③疏肝化痰祛瘀方含有桃仁和红花等破血药，因为桃仁和红花的安全性不足，但乳腺癌是一种特殊的疾病，长期服用利大于弊还是弊大于利，还需要再纳入长期毒性研究验证和观察。

综上所述，疏肝化痰祛瘀方联用紫杉醇对大鼠乳腺癌具有一定的治疗效果，可显著改善乳腺癌的乳腺组织微循环，与降低血流黏稠度和降低乳腺组织的VEGF和bFGF表达有关。

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〔2015-06-17修回〕

(编辑 赵慧玲/曹梦园)

杨 洁(1982-)，女，在读博士，副主任医师，主要从事恶性肿瘤的放射治疗研究。

王玉祥(1969-)，男，博士，主任医师，主要从事恶性肿瘤的放射治疗研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)22-5539-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.020

1 河北省隆尧县医院