趋化因子受体4调节PI3K/Akt和Erk信号通路促进卵巢癌SKOV3细胞上皮细胞-间充质转化

孟巧绒 李 楠 闫 旭

(西藏民族大学附属医院妇产科，陕西 咸阳 712082)



趋化因子受体4调节PI3K/Akt和Erk信号通路促进卵巢癌SKOV3细胞上皮细胞-间充质转化

孟巧绒 李 楠1闫 旭2

(西藏民族大学附属医院妇产科，陕西 咸阳 712082)

目的 观察趋化因子受体4(CXCR4)通过激活PI3K/Akt和Erk信号通路在卵巢癌SKOV3细胞上皮细胞-间充质转化(EMT)中的作用。方法 Boyden小室检测激活CXCR4后SKOV3细胞迁移和侵袭能力的变化情况。Western印迹方法检测激活CXCR4后SKOV3细胞中EMT相关蛋白的表达情况及PI3K/Akt和Erk信号通路的活化情况。PI3K/Akt和Erk信号通路抑制剂预处理SKOV3细胞后，采用Western印迹方法检测SKOV3细胞中EMT相关蛋白的表达情况。结果 同对照组相比，激活CXCR4后可促进SKOV3细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01)，下调SKOV3细胞中与EMT相关的E-钙黏蛋白表达，并上调EMT相关波形蛋白的表达。Western印迹结果显示随着CXCR4刺激时间的延长，SKOV3细胞中PI3K/Akt蛋白和Erk蛋白磷酸化水平逐渐升高。采用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002和Erk信号通路抑制剂U0126预处理SKOV3细胞后，CXCR4介导的E-钙黏蛋白表达下调和波形蛋白表达上调被阻断。结论 CXCR4通过激活SKOV3细胞中的PI3K/Akt信号通路和Erk信号通路，下调SKOV3细胞中E-钙黏蛋白表达，并上调波形蛋白的表达，从而促进卵巢癌SKOV3细胞EMT的发生。

趋化因子受体4；信号通路；上皮细胞-间充质转化；迁移；侵袭

趋化因子是指吸引白细胞移行到感染部位的一些低分子量的蛋白质〔1〕。多种趋化因子及相关受体参与了肿瘤细胞的浸润和转移，在肿瘤的发生发展中具有重要的作用〔2,3〕。趋化因子受体4(CXCR4)是趋化因子受体家族中重要的成员，与乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胰腺导管细胞癌和肝癌等的生长、浸润和转移密切相关〔4～8〕。而CXCR4在卵巢癌中的作用目前研究还很少。据此，本研究对CXCR4激活在诱导卵巢癌SKOV3细胞迁移和侵袭中的作用进行初步探讨，并观察CXCR4激活是否可通过调节PI3K/Akt和Erk信号通路活化而在卵巢癌SKOV3细胞上皮细胞-间充质转化(EMT)中发挥一定的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 卵巢癌SKOV3细胞购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。CXCR4激活所用CXCR4配体基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)购自Peprrotoech公司。E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体、p-Akt抗体和p-Erk1/2抗体购自Cell Signaling Technology公司；LY294002、U0126辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自Snata Cruz公司；100×蛋白酶磷酸酶抑制剂Cocktail 购自Thermo公司；Boyden小室购自Millpore公司。

1.2 细胞培养基处理 采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养卵巢癌SKOV3细胞，待细胞生长至对数生长期开始实验。SKOV3细胞迁移和侵袭能力检测实验及EMT相关蛋白检测实验中，采用200 ng/ml的SDF-1α处理SKOV3细胞48 h。PI3K/Akt信号通路和Erk信号通路活化检测实验中，采用200 ng/ml的SDF-1α处理SKOV3细胞0、5、10和20 min。PI3K/Akt信号通路和Erk信号通路阻断实验中，分别于培养基中加入5 μmol/L的LY294002和30 μmol/L的U0126。

1.3 迁移和侵袭能力检测 采用伤口愈合实验分析CXCR4对卵巢癌SKOV3细胞迁移能力，具体操作方法参见文献〔9〕。采用Boyden小室分析CXCR4对卵巢癌SKOV3细胞侵袭能力的影响，具体操作方法参见文献〔10,11〕。

1.4 SKOV3细胞总蛋白提取 采用CytoBuster 蛋白提取试剂提取上述SDF-1α处理卵巢癌SKOV3细胞的总蛋白：采用预冷冰PBS洗涤细胞2次(400 r/min离心5 min)；弃尽细胞上清后加入适量蛋白酶磷酸酶抑制剂Cocktail和CytoBuster 蛋白提取试剂，涡旋混匀；室温放置15 min；于预冷至4℃离心机中离心(12 000 r/min离心15 min)；吸取上清即为细胞总蛋白。

1.5 蛋白浓度检测 严格按BCA试剂盒说明书操作：将试剂A和试剂B按50∶1的体积比混合配制成工作液；于酶标板中每孔加入200 μl的工作液，并加入25 μl倍比稀释的标准品或待测样品，每种检测条件设置3个复孔。37℃避光孵育30 min；酶标仪在波长562 nm 处测定OD值；根据标准品的光密度值和浓度梯度绘制出标准曲线以推算出样品浓度。

1.6 Western印迹方法 上述提取的细胞总蛋白经8% SDS-PAGE 分离胶和5%浓缩胶分离后，采用湿转的方法将蛋白转印至PVDF膜上。PVDF膜以含5% BSA的TBST室温封闭2 h；加入相应的一抗4℃孵育过夜。第二天用0.1% TBST 洗膜3 次后加入相应种属的HRP标记的二抗，室温孵育1 h。0.1% TBST 洗膜3次，PVDF膜以Supersignal West Pico HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。β-actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。

1.7 统计学方法 采用SPSS15.0软件行采用t检验。

2 结 果

2.1 CXCR4激活对SKOV3细胞迁移和侵袭的影响 对照组、CXCR4刺激组的SKOV3细胞伤口宽度百分比分别为(1.00±0.00)和(0.34±0.15)，CXCR4刺激可显著促进SKOV3细胞的迁移能力(P<0.01)。对照组、CXCR4刺激组的SKOV3细胞发生侵袭的细胞数分别为(156.85±41.95)和(318.56±58.93)，CXCR4刺激可显著促进SKOV3细胞的侵袭能力(P<0.01)。见图1。

2.2 CXCR4激活对SKOV3细胞EMT相关蛋白表达的影响 CXCR4刺激后可下调SKOV3细胞中与EMT相关的E-cadherin表达，并上调EMT相关波形蛋白Vimentin的表达。见图2。

2.3 CXCR4激活对SKOV3细胞中PI3K/Akt和Erk信号通路活化的影响 随着CXCR4刺激处理时间的延长，SKOV3细胞中PI3K/Akt蛋白和Erk蛋白磷酸化水平逐渐升高。见图3。

2.4 阻断PI3K/Akt和Erk信号通路后SKOV3细胞EMT相关蛋白表达情况 阻断SKOV3细胞中PI3K/Akt和Erk信号通路后，CXCR4介导的E-cadherin表达下调和Vimentin表达上调被阻断。见图4。

图1 SKOV3细胞迁移(A)和侵袭能力(B)变化情况

图2 SKOV3细胞E-cadherin和Vimentin表达情况

图3 Western印迹检测Akt和Erk磷酸化情况

图4 SKOV3细胞E-cadherin和Vimentin表达情况

3 讨 论

虽然卵巢癌对化疗敏感，加之目前临床多采用肿瘤根治术和铂加紫杉醇为基础的化疗对卵巢癌进行治疗，然而卵巢癌患者的预后仍不理想，且5年生存率仅为25%〔12〕。已知患者的临床病理参数，如年龄、 肿瘤分期、 患者身体机能和残余肿瘤体积为卵巢癌预后的独立预测因子，然而，即便是状态和治疗相似的患者其生存率也不尽相同〔13〕。

CXCR4是一种G蛋白偶联的趋化因子受体，通过与其相应的配体基质细胞衍生因子(SDF)-1α结合而发挥生物学效应〔14〕。CXCR4/SDF-1α轴在胚胎发育、 巨噬细胞迁移和分化中具有重要的作用〔13〕。一项研究分析了卵巢癌细胞中14种趋化因子受体的表达情况，结果显示，卵巢癌细胞仅表达CXCR4〔15〕，提示CXCR4与卵巢癌的发生发展相关。同时，EMT与卵巢癌的发生和发展密切相关。那么，CXCR4是否可通过介导卵巢癌细胞EMT的发生而参与卵巢癌的发生和发展呢？本研究结果显示，激活CXCR4可显著上调SKOV3细胞的迁移和侵袭能力。CXCR4可通过激活SKOV3细胞中的PI3K/Akt信号通路和Erk信号通路，下调SKOV3细胞中E-cadherin表达，并上调Vimentin的表达，从而促进卵巢癌SKOV3细胞EMT的发生，与文献〔16〕报道的CXCR4发挥作用激活的下游信号通路结果一致。

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3 Sun Y,Zhu D,Wang G,etal.Pro-inflammatory cytokine IL-1β up-regulates CXC chemokine receptor 4 via Notch and ERK signaling pathways in tongue squamous cell carcinoma〔J〕.PLoS One,2015;10(7):e0132677.

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9 Lu J,Getz G,Miska EA,etal.MicroRNA expression profiles classify human cancers〔J〕.Nature,2005;435(7043):834-8.

10 Pisano M,Triacca V,Barbee KA,etal.An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion〔J〕.Integr Biol (Camb),2015;7(5):525-33.

11 Jin UH,Kim SB,Safe S.Omeprazole inhibits pancreatic cancer cell invasion through a nongenomic Aryl hydrocarbon receptor pathway〔J〕.Chem Res Toxicol,2015;28(5):907-18.

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13 Liu CF,Liu SY,Min XY,etal.The prognostic value of CXCR4 in ovarian cancer:a meta-analysis〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e92629.

14 Nagasawa T.CXCL12/SDF-1 and CXCR4〔J〕.Front Immunol,2015;6:301.

15 Sekiya R,Kajiyama H,Sakai K,etal.Expression of CXCR4 indicates poor prognosis in patients with clear cell carcinoma of the ovary〔J〕.Hum Pathol,2012;43(6):904-10.

16 Badr G,Sayed A,Abdel-Maksoud MA,etal.Infection of female BWF1 lupus mice with malaria parasite attenuates B cell autoreactivity by modulating the CXCL12/CXCR4 axis and its downstream signals PI3K/AKT,NFκB and ERK〔J〕.PLoS One,2015;10(4):e0125340.

〔2015-11-12修回〕

(编辑 徐 杰)

孟巧绒(1978-)，女，硕士，主治医师，讲师，主要从事中西医结合妇科研究。

R71

A

1005-9202(2016)22-5547-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.023

1 陕西中医药大学附属医院妇科 2 吉林大学第一医院病理科