简述植物原生质体

关紫荆+崔楠+张雪

[摘 要]植物细胞主要由细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核组成。原生质体由于去掉了细胞壁，细胞膜成为细胞活物质与外界环境的唯一屏障。原生质体可以用来观察各种细胞过程和活动，在不同种类植物中响应光、胁迫、激素等因素的离子通道的调控等研究领域有着重要的应用。酶解液中的离析酶和纤维素酶的浓度是影响原生质体分离的最重要因素之一，不同浓度的酶液组合对原生质体产量和质量的影响有显著差异。

中图分类号：TN784.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）25-0264-01

1. 前言

原生质体可以用来观察各种细胞过程和活动，如在细胞壁的合成，细胞分裂，再生组织的分化，Ca2+ 信号转导和调控，在不同种类植物中响应光、胁迫、激素等因素的离子通道的调控等研究领域有着重要的应用。Cocking自1960年首次用酶法制备番茄根原生质体获得成功之后，植物原生质体的研究才逐渐变得活跃起来。虽然当时还没有有效的DNA导入方法，但原生质体已经成为细胞壁再生、细胞分裂、胚的生成、分化及植物病毒研究的有效工具，经过许多研究者的不断努力，已建立起了酶解分离出原生质体的基本程序。但几乎所有的研究都表明，由于植物本身存在差异性，不同的种类，甚至同种植物不同的供试组织，其原生质体分离所需的条件都存在着很大差异。

原生质体是植物遗传改良的重要实验体系之一，并且为定量研究植物细胞的许多生理和生化过程提供了适宜的实验体系，尤其是与光/叶绿体相关的过程。例如，烟草中光诱导的叶绿体运动；玉米中光诱导的基因表达等。通过原生质体融合可以克服远缘杂交难以克服的障碍等。在小麦离体培养中，可以通过根、茎、叶、花药、胚、穗等各种外植体均可实现植株再生。

2. 离体的原生质体的特点

离体的原生质体具有以下特点：（1） 在悬浮液中彼此完全分离，每个原生质体可看作一个纯粹单细胞，易于定量操作和控制；（2） 在保持培养基中，原生质体内RNA和蛋自质合成能力及光合活性与原组织中的细胞水平接近；（3） 在增殖培养基中，原生质体能以高频率再生胞壁和细胞分裂进而增殖成愈伤组织，在分化培养皿上能再生完整植株；（4） 在诱导条件下，原生质体能发生同源或异源融合，形成聚核体或杂核体，因此是体细胞杂交的理想材料；（5） 原生质体不仅能摄取核酸、蛋白质等高分子物质而且还能摄取病毒、叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的理想工具；（6） 培养中的原生质体会发生变异，若原生质体是纯粹单细胞，则变异原生质体再生植株的变异性状更纯；（7） 原生质体极易被破坏，便于核酸、蛋白质（含酶）等高分子物质及胞核、叶绿体、线粒体、液泡和膜等的分离。

3. 原生质体的研究进展

植物的原生质体是一个成熟的生理的和灵活的电池系统，广泛应用于高通量和基因的功能鉴定分析。绿色植物的原生质体已被成功地用于植物信号转导通路相关的激素和环境调查，代谢产物挑战。水稻的原生质体悬浮培养细胞或黄化苗的制备一般，但只有少数的研究从绿色植物中探索原生质体的使用。

原生质体指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞，“protoplast”一词最早出现于1880年，当时Hanstein用它指由细胞壁包围的活物质。自1971年植物原生质体培养成功以来，关于原土质体的研究层出不穷，被研究的植物也不断增多，研究的结果也逐渐显示出它在作物遗传改良中具有较大的应用潜力。

现在已有不少研究者试图寻找简单有效的原生质体分离方法并已取得了初步成功。Aoyagi 等发展了一种简单的原生质体分离方法，将植物细胞（如悬浮系愈伤组织）进行排气处理，然后将处理的细胞与藻酸钠滴入含有分离原生质体的酶液中，原生质体分离和胶的固化同时进行，此法可以明显缩短时间，而且原生质体的活力较高。

3. 原生质体活力的测定方法

获得的原生质体是否健康和具活力是后续培养成功的关键因素之一。常用于测定原生质体活力的方法计有：染色法、胞质环流法、渗透压变化法等。

4. 影响原生质体分离的因素

从植物材料中是否成功的分离原生质体，是否具有高产量及存活率，受许多因素包括酶种类、组合与浓度，稳压剂类型与浓度，保护物质的应用，酶液酸碱度，保温温度与时间， 保温方式，光照条件及供体植物的生理条件等所影响。（1） 植物的类型、基因型、外植体类型及其生理状态；（2） 植物的生长条件和年龄；（3） 酶液的酸碱度；（4） 酶液的渗透势；（5） 胞壁降解的种类、组分及浓度；（6） 保温温度、时间、方式和通风条件等。

5. 展望

原生质体在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂再生成完整植株。植物游离原生质体已成为现代植物细胞学、细胞遗传工程、生物化学、生理学和病毒学等研究的理想工具，并为这些学科的研究开辟了新途径。在利用原生质体进行遗传饰变研究方面应尤为赋予更多注意。

一些遗传上异源的或多倍体植物的同一个体来源的体细胞中往往产生无性分离的现象，同时培养过程中发生体细胞变异，原生质体为分离其中的有用变异提供了机会。正是这一特殊性能，使原生质体成为植物遗传育种的一个理想的受体系统。在植物遗传物质的导入和表达的研究及作物优良品种的选育中，植物原生质体培养技术发挥着其独特而有效的作用。

参考文献

[1] 席海秀，艾可筠，佟少明.普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化. 生物技术通报， 2016（4）.

[2] Fontes N， Silva R， Vignault C， et al. Purification and functional characterization of protoplasts and intace vacuoles from grape cells. BMC Res Notes.2010，3：19.

[3] Zhang Y， Su J， Duan S， et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related？processes. Plant Methods，2011，7（1）：30.

[4] Dlugosz EM， Lenaghan SC， Stewart CN Jr. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J Vis Exp.2016，27：（115）.

[5] Shen J，Fu J，Ma J，et al. Isolation， culture， and transient transformation of plant protoplasts. Curr Protoc Cell Biol.Curr Protoc Cell Biol.2014，63：2.8.1-17.