海洋来源真菌Penicillimgrisefulvum中桔霉素类化合物的分离及抗菌活性

高 彤, 蔡思源, 许兰兰, 曹 飞, 朱华结

(药物化学与分子诊断教育部重点实验室, 河北省药物质量分析控制重点实验室,河北大学药学院, 保定 071002)



海洋来源真菌Penicillimgrisefulvum中桔霉素类化合物的分离及抗菌活性

高 彤, 蔡思源, 许兰兰, 曹 飞, 朱华结

(药物化学与分子诊断教育部重点实验室, 河北省药物质量分析控制重点实验室,河北大学药学院, 保定 071002)

以海洋来源青霉真菌Penicillimgrisefulvum为研究对象, 采用硅胶、 C18柱和Sephadex LH-20凝胶柱层析等手段, 从中分离获得3个桔霉素类化合物: 7-methyl-penicitrinone A(1), citrinin(2)和penicitrinone A(3), 其中化合物1为新化合物. 通过一维核磁共振谱(1D NMR)、 二维核磁共振谱(2D NMR)和高分辨质谱(HR-ESI-MS)对化合物1的平面结构和相对构型进行确定, 并运用电子圆二色光谱(ECD)和量子化学计算方法确定了其绝对构型. 抗菌活性测试结果表明, 化合物1对副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)表现出了较强的抑制活性(MIC=0.8 μmol/L), 高于阳性对照药物环丙沙星的活性(MIC=1.3 μmol/L).

海洋真菌;Penicillimgrisefulvum; 桔霉素衍生物; 抗菌活性

海洋生物所处的高盐、 高压、 低温及寡营养等特殊环境使之能够产生结构新颖和活性多样的次级代谢产物. 海洋来源微生物, 特别是海洋真菌[1～4], 已成为药物先导化合物研究的重要生物资源之一, 被认为是极具潜力的药物开发资源[5,6]. 目前, 已经从海洋来源的青霉属真菌中分离得到青霉素类、 聚酮化合物、 萜烯、 桔霉素及其氨基酸衍生物等多种结构类型的次级代谢产物[7], 如从青霉Penicilliumchrysogenum中分离得到青霉素[8], 从青霉Penicilliumsolitum中分离出美伐他汀及从青霉Penicilliumbrevicompactum中发现了霉酚酸等[9].

本文选择海洋来源真菌灰黄青霉(Penicillimgrisefulvum)为研究对象, 从其中分离得到3个桔霉素类衍生物7-methyl-penicitrinone A(1), citrinin(2)和penicitrinone A(3), 其中化合物1是新化合物. 活性测试结果表明, 化合物1～3均显示出不同程度的抗菌活性.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

所用试剂均为分析纯. 菌株采自深圳大亚湾海域, 筛选出的真菌经由北京三博远志技术有限责任公司鉴定为灰黄青霉(Penicillimgrisefulvum), 该菌株的菌株编号为KT781166(见本文支持信息表S1).

MOS-450型圆二色光谱仪(法国Bio-logic公司); AA-55系列全自动旋光仪(英国Optical Activity 公司); Avance Ⅲ 600 MHz核磁共振仪(TMS为内标, 德国Bruker公司); Micromass Q-TOF质谱仪(ESI-MS, 美国Waters公司); MAT95XP型高分辨质谱仪(美国Thermo公司); 紫外分光光度计(北京恒通瑞利公司); LC-20A型循环半制备色谱仪(日本岛津公司); YRT-3型熔点仪(天津精拓仪器科技有限公司); 正相柱色谱硅胶(青岛海洋化工); 凝胶Sephadex LH-20(美国Pharmacia公司); C18反相填料(日本YMC公司); GF254薄层色谱用硅胶(烟台化学工业研究所).

1.2 实验过程

1.2.1 真菌培养 真菌发酵培养基: 大米(100 g/瓶)+真菌二号培养基(100 mL/瓶). 真菌二号培养基组成: 甘露醇(20 g/L)+酵母膏(3 g/L)+MgSO4·H2O(0.3 g/L)+味精(10 g/L)+葡萄糖(10 g/L)+KH2PO4(0.5 g/L)+麦芽糖(20 g/L)+玉米浆(1 g/L), 调节pH为6.5～7.0. 共发酵40瓶, 室温下培养43 d.

1.2.2 提取和分离 将每瓶菌丝体用二氯甲烷/甲醇(体积比1∶1)溶液浸泡, 超声提取5次, 减压浓缩成浸膏(300.0 g), 再用乙酸乙酯萃取到无色, 得到乙酸乙酯相(166.3 g). 将乙酸乙酯相过减压正相硅胶柱, 以石油醚/乙酸乙酯(体积比分别为100∶1, 80∶1, 50∶1, 20∶1, 5∶1和1∶1)溶液为流动相进行梯度洗脱, 用薄层色谱板检测得到6个组分Fr.1～Fr.6. 组分Fr.5采用重结晶方法得到化合物2(23.0 mg); 组分Fr.3经C18柱[V(甲醇)∶V(水)=4∶1]、 硅胶柱[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=30∶1]以及高效液相色谱[V(甲醇)∶V(水)=4∶1]分离得到化合物1(5.0 mg); 组分Fr.4经过Sephadex-LH-20(甲醇)、 硅胶柱[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1]及高效液相色谱[V(甲醇)∶V(水)=19∶1]分离得到化合物3(10.0 mg).

1.2.3 抗菌活性测试 测试了分离所得化合物的活性. 首先对致病细菌伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、 鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)进行培养, 然后将致病细菌接种到PYG培养基[葡萄糖(20 g/L)+蛋白胨(10 g/L)+酵母膏(10 g/L)]并培养活化12 h, 吸取10 μL至PYG空白培养基中进行稀释. 用无菌移液枪将96孔板的第一排加入198 μL菌液和2 μL样品, 其它孔加入100 μL菌液, 将第一排的样品和菌液混匀, 吸取100 μL依次向下加, 进行2倍递减梯度稀释, 最后补至200 μL, 使第一排样品浓度为25 μmol/L, 测定最小抑菌浓度. 最后3列为环丙沙星阳性对照、 空白对照及DMSO阴性对照.

2 结果与讨论

2.1 化合物结构解析

化合物7-methyl-penicitrinone A(1)为橙黄色粉末, 易溶于甲醇, [α]20D=+48.0°(c1.5, CH3OH); ESI-MS,m/z: 395.3[M+H]+; HRESI-MS,m/z: 395.1853[M+H]+, 分子式C24H26O5, 不饱和度为12; UV,λ/nm: 208, 252, 288. 由1H NMR谱数据(表1)可知, 化合物1存在7个甲基信号, 其中有3个甲基连接在芳香碳上; 还存在4个次甲基及1个连接苯环的羟基. 由13C NMR谱数据(表1)可知, 化合物1存在12个烯属碳信号和1个羰基碳信号. 根据文献[10]报道, 该化合物与桔霉素衍生物pennicitninone A(3)的结构十分相似, 化合物1与化合物pennicitninone A(3)的不同之处仅在于在化合物1中多出1个甲基信号.

在化合物1的HMBC谱(图1)中, 7-Me与C6, C7和C8之间存在相关信号, 表明该甲基连接于C7位. 通过1H-1H COSY, HMQC和HMBC进一步确定了该化合物的平面结构. 由化合物1的NOESY数据可知, 2′-H与3′-Me之间以及3′-H与2′-Me之间存在相关信号, 表明2′-H和3′-H处于化合物平面的异侧; 此外, 3-H与4-Me之间以及4-H与3-Me之间存在相关信号, 表明3-H和4-H也处于化合物平面的异侧. 以上结果表明, 化合物1与化合物3具有相同的相对构型, 同时结合文献[10]报道, 化合物1中2′-H和3′-H之间的耦合常数为3.6, 表明化合物1相对构型的正确性. 化合物1的质谱及核磁谱图如图S1～图S8所示(见本文支持信息).

化合物1的绝对构型通过圆二色光谱(ECD)实验值与计算值[11～15]的比较来确定. 首先利用软件通过分子动力学力场MMFF94S方法对分子(2′R,3′S,3R,4S)-1进行构象搜索, 共得到6个能量最低构象(ΔE=0～12.552 kJ/mol), 对该6个构象分别在B3LYP/6-311+G(d)基组水平上进行优化计算, 对优化后的6个构象再在B3LYP/6-311++G(2d,p)基组上进行ECD计算[16], 通过玻尔兹曼加合来拟合ECD谱图. 通过比对实验ECD谱与计算ECD谱(图2)发现, 两者之间吻合较好, 表明化合物1的绝对构型为(2′R,3′S,3R,4S). 化合物1的计算ECD数据和实测ECD数据见表S2和表S3(见本文支持信息).

Table 1 1H NMR, 13C NMR and HMBC data of compound 1

Fig.1 Structures of compounds 1—3 and key HMBC and COSY of compound 1

Fig.2 Calculated and experimental ECD spectra of compound 1

化合物2: 橙黄色针状结晶, m. p. 173.2～174.3 ℃(文献值[17]: 175～177 ℃), [α]20D=-15.0°(c2.0, CH2Cl2), 分子式C13H14O5, ESI-MS,m/z: 251[M+H]+. 以上数据与文献[17～20]报道一致, 因此鉴定为citrinin. 其核磁谱图见图S9和图S10(见本文支持信息).

化合物3: 黄色粉末, m. p. 150.4～151.7 ℃(文献值[10]: 150～152 ℃), [α]20D=+140.0°(c2.0, CH2Cl2), 分子式C23H24O5, ESI-MS,m/z: 381[M+H]+. 以上数据与文献[10,21]报道一致, 因此鉴定为penicitninone A. 其核磁谱图见图S11和图S12(见本文支持信息).

2.2 抗菌活性

测定了3个化合物分别对致病细菌伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、 鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)的活性, 结果如表2所示, 化合物1对副溶血性弧菌表现出很强的抑菌活性, 最低抑菌浓度为0.8 μmol/L, 化合物2和3对伤寒沙门氏菌的抑菌活性显著, 最低抑菌浓度均为0.4 μmol/L. 化合物1～3的抗菌活性均高于对照药环丙沙星.

Table 2 Antibacterial Activities of compounds 1—3(MIC, μmol/L)

3 结 论

通过对灰黄青霉固体发酵, 并用二氯甲烷/甲醇(体积比1∶1)溶液浸泡和乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯相, 经柱层析分离得到3个化合物, 通过结构解析和鉴定确定为7-methyl-penicitrinone A(1), citrinin(2)和penicitrinone A(3), 其中化合物1是新化合物. 化合物1～3均表现出很强的抗菌活性.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20160315.

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(Ed.: P, H, S, K)

Citrinin Derivatives from Marine-derived FungusPenicillimGrisefulvumand Antibacterial Activity†

† Supported by the Science and Technology Support Project of Baoding, China(No.15ZN020), the Scientific Rsearch Foundation of Hebei Educational Committee, China(No.QN2016177) and the Financial Support from the Hebei University, China.

GAO Tong, CAI Siyuan, XU Lanlan, CAO Fei*, ZHU Huajie*

(KeyLaboratoryofMedicinalChemistryandMolecularDiagnosis,MinistryofEducation,KeyLaboratoryofPharmaceuticalQualityControlofHebeiProvince,CollegeofPharmaceuticalSciences,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

The marine fungusPenicillimgrisefulvumwas cultivated with 43 d at 28 ℃, bioassay-guide fractionation of the marine fungusPenicillimgrisefulvumled to the isolation of three citrinin derivatives(1—3), which were separated by silica gel column chromatography, C18column chromatography, Sephadex LH-20, and semi-preparative HPLC. Based on the HR-ESI-MS, 1D and 2D NMR, compounds 1—3 were assigned as 7-methyl-penicitrinone A(1), citrinin(2) and penicitrinone A(3), respectively. The absolute configuration of compound 1 was determined by comparision of experimental and calculated electronic cicular dichroism(ECD) data. Compound 1 displayed strong antibacterial activity againstVibrioparahemolyticus(MIC=0.8 μmol/L), which was stronger than the positive control of ciprofloxacin(MIC=1.3 μmol/L).

Marine fungus;Penicillimgrisefulvum; Citrinin derivative; Antibacterial activity

2016-05-06.

日期: 2016-06-27.

保定市科技支撑项目(批准号: 15ZN020)、 河北省教育厅资助科研项目(批准号: QN2016177)和河北大学人才引进项目资助.

10.7503/cjcu20160315

O629.9

A

联系人简介: 曹 飞, 男, 博士, 讲师, 主要从事海洋天然药物研究. E-mail: caofei542927001@163.com

朱华结, 男, 博士, 教授, 主要从事手性药物化学研究. E-mail: zhuhuajie@hotmail.com