1,25-二羟维生素D3对棕榈酸诱导巨噬细胞炎症因子表达的影响

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(1.南华大学医学院诊断学教研室，湖南 衡阳 421001；2.南华大学心血管疾病研究所)

·基础医学·

1,25-二羟维生素D3对棕榈酸诱导巨噬细胞炎症因子表达的影响

陈雯1，朱肖2，冯聚玲1，李熠1，游咏1，桂庆军1，尹凯1,2*

(1.南华大学医学院诊断学教研室，湖南 衡阳 421001；2.南华大学心血管疾病研究所)

目的研究1,25-二羟维生素D3(1,25(OH)2D3)对棕榈酸(PMA)诱导THP-1巨噬细胞炎症因子表达的影响及其机制。方法用1,25(OH)2D3(10 nmol/L)和/或PMA(250 μmol/L)处理THP-1巨噬细胞6 h，采用荧光定量PCR和酶联免疫吸附法(ELISA)法检测肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-10的表达水平；用1,25(OH)2D3和/或PMA处理THP-1巨噬细胞60 min，采用免疫印迹(Western-blot)法检测AMPKα1和磷酸化AMPKα1(p-AMPKα1)水平。结果1,25(OH)2D3(10 μmol/L))明显抑制PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬细胞TNFα、IL-1β和IL-6的表达，并上调IL-10的表达；1,25(OH)2D3显著上调THP-1巨噬细胞AMPKα1的磷酸化水平。结论1,25(OH)2D3抑制PMA诱导的THP-1巨噬细胞炎症因子表达，该效应可能与其激活AMPKα1有关。

1,25-二羟维生素D3； 棕榈酸； 巨噬细胞； 炎症反应

维生素D(Vitamin D，VD)是一种脂溶性维生素，主要由皮肤合成和食物摄取。近来研究发现，VD不仅参与调节体内钙磷代谢，其水平还与多种慢性炎症疾病，如肥胖、2型糖尿病和动脉粥样硬化(Atherosclerosis，As)等的发生呈显著负相关，提示VD可能对体内代谢性因素引起的慢性炎症具有重要的调节作用[1]。VD进入血液后，经肝脏25-羟化酶和肾脏共同作用转化为具有活性的1,25-二羟维生素D3(1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3)。研究报道1,25(OH)2D3能够抑制脂多糖(LPS)诱导的急性炎症反应[2]。本实验组前期发现，1,25(OH)2D3能够调节THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出，并促进IL-4诱导的巨噬细胞M2型极化[3]。血清游离脂肪酸(Free fat acid，FFA)水平升高是肥胖和2型糖尿病的主要脂质代谢紊乱特征，然而1,25(OH)2D3是否调节FFA诱导的巨噬细胞炎症尚不明确。本研究拟探讨1,25(OH)2D3对棕榈酸(PMA)诱导的THP-1巨噬细胞炎症因子表达的影响和机制，为进一步研究VD与慢性代谢性疾病的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂棕榈酸购自Sigma公司；1,25(OH)2D3购自美国Peprotech公司；人单核细胞株(THP-1)购自中科院上海细胞生物所细胞中心；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清和小牛血清购自杭州四季清生物工程材料有限公司；兔抗人AMPKα1单克隆抗体和兔抗人AMPKα1 (phospho T172)多克隆抗体购自ABCam公司；小鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自康成生物科技公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗购自武汉博士德公司；TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA试剂盒购自R&D Systems公司；引物均由上海生物工程公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2细胞培养人单核细胞株(THP-1)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37 ℃、5%CO2培养箱中静置培养。培养液中加10 mmol/L的羟乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、链霉素各1.0×105U/L。在每次实验前用160 nmol/L佛波酯(PMA)孵育THP-1细胞12 h，使其诱导分化成巨噬细胞。

1.3实时定量PCR 将1 μg总RNA用逆转录试剂盒(Fermentas)反转录成20 μL cDNA。采用应用生物系统7900HT(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)进行实时定量PCR，试剂盒为FINNZYMES公司的DyNAmoTMSYBR®Green qPCR Kits。扩增混合体系包括：去离子水13.5 μL,Master Mix 15 μL,cDNA 1μL,Primer 0.5 μL,共30 μL。溶解曲线分析表明PCR反应产物为单独的双链DNA。用ΔΔCt值法，以GAPDH表达为内参定量其它基因的表达。人TNFα引物序列为：上游 5′-CAGAGGGAATTCC CCAG-3′，下游：5′-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3′；人IL-1β引物序列为：上游 5′-ATGGCACAAGTACCTAAGCTCGC-3′，下游：5′-ACACAAATTGCATGGTGAAGTC AGTT-3′；人IL-6引物序列为：上游 5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3′，下游：5′-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′；人IL-10引物序列为：上游 5′-GACTCCAA GAGA AAGGCATCTAC-3′，下游：5′-CCCTGATGTCTCAGTTTCGTATC-3′；人GAPDH引物序列：上游 5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3′，下游 5′-GAGTCC TTCCACGATACCAAAG-3′。

1.4 ELISA法检测炎症因子表达THP-1细胞以5×104个/孔接种于96孔板，以含10%的胎牛血清(FCS)培养，诱导分化为巨噬细胞。按不同处理因素进行处理，处理前加无血清培养基，处理后收集培养基，存储于-20 ℃冰箱备用。按说明书方法，将100 μL样品和标准品加入板孔，盖上封板膜，室温孵育1～2 h。扣去孔内液体，重复洗板3次。加入50～100 μL生物素标记抗体，孵育1～2 h。扣去孔内液体，又重复洗板3次。加入抗生物素蛋白链菌素-HRP，室温孵育30 min。重复洗板3次后，加入显色剂，室温孵育10～20 min。终止反应后，用450 nm波长读值。

1.5 Western-blot技术检测AMPKα1和p-AMPKα1表达将收集好的细胞进行裂解，于4 ℃离心10 min，弃除沉淀，用BCA法进行蛋白质定量。上样缓冲液调各组蛋白量一致，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶(AnyKD)，100 mV电泳2 h后转移(4 ℃，100 mA，2 h)至PVDF膜上，丽春红染色观察转移效果，并确定蛋白分子量标准的位置。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭2 h，按1∶500加入兔抗人AMPKα1或p-AMPKα1或GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃培育过夜，TBST洗三次，1∶1000 加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温培育1 h，TBST洗三次，用Western blot免疫印迹荧光检测试剂盒激发荧光，结果用Labwork凝胶图像分析系统获取各条带的光密度值(OD值)。

1.6统计学处理实验所得数据采用均数±标准差表示，两组间比较采用方差分析及t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2.1 1,25(OH)2D3抑制PMA诱导THP-1巨噬细胞炎症因子的表达用1,25(OH)2D3(10 nmol/L)和/或PMA(250 μmol/L)处理THP-1巨噬细胞6 h，采用荧光定量PCR和ELISA法检测TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10的表达水平。如图1和图2所示，1,25(OH)2D3(10 nmol/L)显著抑制PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬细胞TNFα、IL-1β和IL-6的表达，并上调IL-10的表达水平。

图1 1,25(OH)2D3对PMA作用下THP-1巨噬细胞炎症因子mRNA表达的影响(n=3) 荧光定量PCR法检测TNFα(左上图)、IL-1β(右上图)、IL-6(左下图)和IL-10(右下图)mRNA的表达(1,25(OH)2D3+PMA 与PMA组比较，*：P<0.05)

2.2 1,25(OH)2D3上调PMA作用下THP-1巨噬细胞AMPKα1磷酸化用1,25(OH)2D3处理THP-1巨噬细胞不同时间(0，15,30,60,120 min)，采用Western-blot检测AMPKα1和磷酸化AMPKα1的表达，如图3所示，1,25(OH)2D3上调THP-1巨噬细胞磷酸化AMPKα1水平。选择60 min为时间点，如图4所示，PMA下调THP-1巨噬细胞AMPKα1磷酸化，而1,25(OH)2D3显著上调PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬细胞AMPKα1磷酸化水平。

3 讨 论

流行病学调查显示，我国超过90%以上的人群存在VD缺乏(参照美国内分泌学会指南，血清25-羟胆钙化醇(25(OH)D3)含量低于20 ng/mL为VD缺乏，低于30 ng/mL为VD不足)，提示VD缺乏是我国重要的健康问题[4]。除了参与钙磷代谢，VD缺乏与多种慢性炎症疾病密切相关，然而VD与上述疾病是否存在直接因果关系尚不明确[1]。1,25(OH)2D3是VD在体内的活性成分，通过与维生素D受体(VDR)结合，启动胞内机制发挥调节免疫功能、抑制炎症和抗氧化等作用[5]。在前期研究中，发现VD能够显著促进As斑块巨噬细胞向抗炎M2型极化，从而抑制As的发生发展[3]。在本研究中，发现1,25(OH)2D3能够抑制PMA诱导的巨噬细胞炎症反应，这进一步为VD与肥胖/2型糖尿病相关提供了直接的实验证据。

近来研究发现，细胞代谢在调节巨噬细胞免疫/炎症过程中起着关键作用[6]。在FFA、游离胆固醇等促炎因素作用下，巨噬细胞脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation，FAO)水平明显下降，有氧糖酵解(Aerobic Glycolysis，AG)活性显著增加，导致细胞呈促炎状态，表现为促炎因子TNFα、IL-1β和IL-6的上调及抗炎因子IL-10的下调[7-8]。5′单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)是维持细胞代谢平衡的关键蛋白酶，由α、β和γ 3个亚基组成的异源三聚体蛋白，其中α亚单位起催化作用，β和γ亚单位起稳定作用[9]。研究证实，肥胖状态下ATM的AMPK活性受到显著抑制，细胞FAO水平明显下降，AG活性显著增加，因此调节AMPK活性成为改善胰岛素抵抗和2型糖尿病新的靶点[10]。Li等[11]最近报道VD能够通过激活AMPK/mTOR信号增强二甲双胍对前列腺癌细胞的抑制作用[11]。VD能够通过激活自噬介导的AMPK信号减轻鱼藤酮引起的神经损伤[5]。在本研究中，发现PMA能够下调AMPKα1的磷酸化水平，而VD能够显著上调PMA作用下THP-1巨噬细胞AMPKα1的磷酸化水平，提示AMPKα1活化可能参与了VD对PMA诱导巨噬细胞促炎/抗炎因子表达的调节作用。然而，VD抑制PMA诱导的巨噬细胞炎症反应是否通过调节细胞FAO/AG，将在后续实验中进一步证实。

图2 1,25(OH)2D3对PMA作用下THP-1巨噬细胞炎症因子表达的影响(n=3) ELISA法检测TNFα(左上图)、IL-1β(右上图)、IL-6(左下图)和IL-10(右下图)的表达(1,25(OH)2D3+PMA与PMA组比较，*：P<0.05)

图3 1,25(OH)2D3对THP-1巨噬细胞AMPKα1和p-AMPKα1表达的影响(n=3) Western blot法检测AMPKα1和p-AMPKα1表达(与0 min组比较，*：P<0.05)

图4 1,25(OH)2D3对PMA作用下THP-1巨噬细胞AMPKα1和p-AMPKα1表达的影响(n=3) Western blot法检测AMPKα1和p-AMPKα1表达(与control组比较，*：P<0.05；与PMA组比较，#：P<0.05)

综上，本实验证实VD抑制PMA诱导的巨噬细胞炎症因子表达，并激活THP-1巨噬细胞AMPKα1磷酸化水平，这将为肥胖和2型糖尿病的防治提供一种新的思路。

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1,25-dihydroxyvitaminD3SuppressesPalmiticAcid-inducedInflammatoryCytokinesExpressionintheTHP-1Macrophage

CHEN Wen，ZHU Xiao，FENG Juling，et al
(ResearchLabofTranslationalMedicine,MedicalSchool,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of 1,25-dihydroxyvitamin D(1,25(OH)2D3) on palmitic acid(PMA)-induced inflammatory cytokines expression in THP-1 macrophage.MethodsThe THP-1 macrophages were cultured and incubated with 1,25(OH)2D3(10 nmol/L) and/or PMA(250 μmol/L) for 6h.The RT-PCR and ELISA technology were used to detect mRNA and protein expression of inflammatory cytokines including TNFα,IL-1β,IL-6 and IL-10 in different groups.The THP-1 macrophages were treated with 1,25(OH)2D3and/or PMA for 60min.The westernblot technology was used to detect the expression of AMPKα1 and AMPKα1 phosphorylation.Results1,25(OH)2D3obviously abolished the effect of PMA on the expression of inflammatory cytokines including TNFα,IL-1β,IL-6 and increased the expression of IL-10 in THP-1 macrophages.1,25(OH)2D3significantly promoted the phosphorylation of AMPKα1 in THP-1 macrophages.Conclusion1,25(OH)2D3can suppress PMA-induced inflammatory cytokines expression in THP-1 macrophages via regulation of AMPKα1 phosphorylation.

1,25-dihydroxyvitamin D； palmitic acid； macrophage； inflammation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.008

2016-04-09；

2016-06-28

国家自然科学基金资助项目(81100213，81470569)；南华大学博士启动基金(2015XQD49)；南华大学留学归国人员启动基金(2015XQD55).

*通讯作者，E-mail：kaiyinby@hotmail.com.

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