野黄芩素通过PI3K/Nrf2/HO-1途径减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤

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(南华大学附属第二医院急诊科，湖南 衡阳 421001)

·基础医学·

野黄芩素通过PI3K/Nrf2/HO-1途径减轻LPS诱导的大鼠急性肺损伤

王彪，袁娜*，张永虎，曾良

(南华大学附属第二医院急诊科，湖南 衡阳 421001)

目的探讨野黄芩素(SCT)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠表达血红素氧合酶-1(HO-1)的机制。方法大鼠静脉内注射LPS(30 mg/kg)以诱导ALI。1h后分别给予不同浓度的SCT(0.1，0.5和1.0 mmol/kg)静脉注射。获肺组织标本，实时定量PCR和Western blot分别检测血红素氧合酶-1(HO-1)mRNA及蛋白的表达；比色法检测HO-1酶活性；HE染色观察病理学改变情况。提取组织总蛋白和核蛋白，Western blot检测PI3K磷酸化以及Nrf2核转位情况，同时观察SCT处理前后对大鼠血浆中TNF-α，IL-6和IL-10水平的影响。

野黄芩素； 急性肺损伤； 血红素氧合酶1

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是急诊科最常见的危重病之一，其病理学上主要表现为肺泡毛细血管广泛损伤，导致炎症相关因子、蛋白酶和活性氧类过度释放，并引起肺水肿、缺氧和纤维蛋白沉积[1]。ALI发生的过程中，多种细胞因子与炎症相关介质参与了本病的发生与发展过程，如TNF-α、IL-1和IL-6，高迁移率蛋白(high-mobility mobility group box,HMGB)1、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,iNOS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)等[2]。尽管目前对ALI的治疗方法有了较大的提高，但其死亡率依然可高达30%以上。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是催化血红素分解为Fe2+，胆绿素和CO的限速酶。研究表明，HO-1及其代谢产物对中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞介导的炎症反应具有一定的抑制作用[3]。体外研究也表明，ALI大鼠给予药物诱导HO-1表达后，可显著降低其死亡率。这表明HO-1 对ALI的炎症反应与氧化应激具有一定的负向调控作用[4]。野黄芩素(Scutellarein，SCT)是从黄芩中分离出的一种黄酮类化合物单体。体外研究表明，SCT具有一定的抗炎与抗氧化活性，并能抑制核转录因子NF-κB的激活[5-6]。但SCT对ALI是否也具有保护作用目前仍不明确。本研究旨在探究LPS诱导的ALI动物模型中，SCT能否影响HO-1的表达，并观察其与细胞因子分泌的关系。

1 材料与方法

1.1主要试剂与材料野黄芩素(SCT，纯度98%)，锡原卟啉(SnPP，纯度98%)购自Sigma-Aldrich。抗HO-1多克隆抗体、抗Nrf2多克隆抗体、抗鼠β-actin以及抗TATA盒结合蛋白(TBP)多克隆抗体购自Santa Cruz。抗p85α磷酸化和抗总p85α抗体购自Cell Signaling。HRP标记IgG抗体购自Abcam。Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自Bio-Rad。TNF-α，IL-6和IL-10 ELISA检测试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂购自Roche；cDNA逆转录试剂盒购自Applied Biosystems，RNA提取试剂盒购自GIBCO。细胞蛋白提取试剂盒购自Thermo。雄性8～10周龄SPF级Wistar大鼠(动物许可证号：SCXK(湘)2015-0001，体重260～290 g)购自南华大学实验动物中心。

1.2 ALI模型的建立与实验分组60只Wistar大鼠于(23±1)℃、(55±5)%湿度环境下给予正常饲料喂养。本研究符合本校实验动物伦理委员会批准。大鼠采用1.5 g/kg的乌拉坦腹腔内注射麻醉后，参照参考文献提供的方法建立体外ALI模型[7]，并根据不同的实验目的分为6组(对照组、LPS组、0.1、0.5、1.0 mmol/kg不同浓度SCT干预组、SnPP干预组)，每组10只大鼠。对照组：大鼠颈静脉滴注9 mL生理盐水，该过程持续4 h，并在滴注生理盐水1 h后再经股静脉注入2 mL林格氏液。LPS组：将LPS(30 mg/kg)溶解于9 mL生理盐水中，颈静脉滴入大鼠。在滴注LPS 1h后，大鼠同时给予2 mL林格氏液。4 h后用于下一步研究。SCT干预组： LPS建模开始1 h后，同时滴入不同浓度SCT(0.1，0.5和1.0 mmol/kg，用林格氏液溶解)[8]。 SnPP干预组：在LPS滴入前6 h腹腔注射30 mg/kg SnPP，其他同SCT干预组。

1.3实时定量PCR检测HO-1 mRNA表达用Trizol试剂提取大鼠肺组织总RNA并测量其浓度。取2 μg RNA将其逆转录为cDNA。设计并合成HO-1与β-actin引物，其中HO-1引物序列分别为：5′-CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC -3′(正向)和5′-AGACGCTTTACGTAGTGCTG -3′(反向)；β-actin：5′-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3′(正向)和5′-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3′。将上述cDNA产物置于实时定量PCR仪器上(Roche,LightCycle 480)，设置反应条件： 95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 10 s、61 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s，共35个循环。通过比较HO-1和β-actin的Ct值，计算其相对倍数表示(2-ΔΔCt)。

1.4 Western blot检测蛋白表达与激酶磷酸化将肺组织中加入含蛋白酶抑制剂的Cocktails并制成匀浆，随后加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液充分裂解。胞浆和核蛋白提取试剂盒严格根据厂家说明书进行。将分别获得的总蛋白用于检测HO-1表达或PI3K磷酸化，核蛋白用于Nrf2核转位分析。总蛋白或核蛋白用Bradford法于595 nm波长处测定其浓度后，取20 μg蛋白用于12%聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)。随后将蛋白凝胶转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。随后分别孵育一抗、辣根过氧化物酶标记的二抗，ECL发光、显影。

1.5 HO-1酶活性测定将大鼠肺组织制成匀浆，离心获取上清用于HO-1酶活性分析。取400 μL上清建立反应体系(0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸盐、0.2 U葡糖糖6磷酸盐-1脱氢酶、2 mg大鼠肝脏胞浆、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血红素)。37 ℃避光孵育1 h，以生成的胆红素量表示HO-1活性，单位为nmol/(mg protein·h)。最后加入1 mL氯仿终止反应。在酶标仪(imark,Bio-Rad)上设置双波长(463 nm和530 nm)测吸各反应管的吸光度，结果以相对值表示(待测组/对照组)。

1.6细胞因子测定大鼠处理结束后获取其血清，采用双抗体夹心ELISA法测定TNF-α，IL-6和IL-10浓度。根据试剂盒提供的操作步骤，在包被有相应细胞因子抗体的微孔板中加入100 μL待测血清，37 ℃孵育2 h。经洗涤后，按照试剂盒的步骤分别加入一抗、二抗孵育。显色后，测定450 nm处的吸光度值，并根据标准曲线计算TNF-α，IL-6和IL-10的浓度。

1.7病理组织学分析肺组织用10%福尔马林固定，用石蜡包埋后制备成厚度为4 μm的切片后用苏木精和曙红染色，并根据组织水肿和中性粒细胞渗出对肺组织的病理损伤进行评分(损伤程度分为0～3级)，最终分数为水肿和渗出评分之和[7]。

1.8统计学分析所有计量资料以均数±标准差表示，并使用GraphPad Prizm 6.0统计软件(San Diego,CA)分析数据，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 SCT促进ALI大鼠肺组织中HO-1 mRNA和HO-1蛋白表达与对照组相比，大鼠注射LPS后肺HO-1 mRNA表达有轻度增高。而给予1.0 mmol/kg SCT处理后HO-1 mRNA表达水平显著上调(P<0.05，图1A)，HO-1蛋白表达与qPCR结果类似(图1B)。

2.2 SCT上调ALI大鼠肺组织中HO-1的酶活性

模型组大鼠肺组织中HO-1酶活性轻微增高。给予0.1～1.0 mmol/kg SCT处理后，大鼠肺组织中HO-1酶活性随SCT浓度的递增逐渐增强。其中给予1.0 mmol/kg SCT处理后，HO-1的酶活性是模型组的2.2倍(图2)。

2.3 SCT诱导ALI大鼠肺组织中PI3K磷酸化的影响未处理组大鼠肺组织中PI3K亚基p85α磷酸化水平较低。用不同浓度SCT干预后，能有效上调磷酸化p85α的水平。在所有处理组中，总p85α水平保持恒定(图3)。

图1 SCT对肺HO-1 mRNA和HO-1蛋白表达的影响 A：SCT诱导ALI大鼠表达HO-1 mRNA.与LPS阴性对照组相比，*P<0.05；与0.1和0.5 mmol/kg SCT比较，#P<0.05；B：SCT诱导肺组织HO-1蛋白表达

图2 SCT上调ALI大鼠肺组织中HO-1酶活性 与LPS阴性对照组相比，*P<0.05；与0.1和0.5 mmol/kg SCT比较，#P<0.05

图3 SCT对肺组织中PI3K磷酸化的影响 与LPS阴性对照组相比，*P<0.05；与0.1和0.5 mmol/kg SCT比较，#P<0.05

2.4 SCT诱导核转录因子Nrf2核转位与正常对照组相比，ALI模型组大鼠肺组织内细胞核中Nrf2表达水平仅轻微增高。经SCT处理后，细胞核中Nrf2水平明显增多，而胞浆中的Nrf2含量随之减少，表明SCT能诱导Nrf2从细胞浆转移至细胞核中(图4)。

图4 CPC对肺组织中Nrf2核转位的影响 与对照组相比，*P<0.05

2.5 SCT对血浆TNF-α，IL-6和IL-10水平的影响

ELISA结果显示，对照组大鼠血浆中TNF-α，IL-6和IL-10浓度较低。给予LPS注射后，其含量显著增高。同时给予不同浓度的SCT处理后，TNF-α和IL-6有所降低，而IL-10明显增高。若给予HO-1抑制剂SnPP处理后，可在一定程度上消除SCT对细胞因子的影响，见表1。

表1不同浓度LE对ALI大鼠血浆细胞因子水平的影响(n=8)

TNF⁃α(ng/mL)IL⁃6(ng/mL)IL⁃10(pg/mL)对照组31．5±11．715．5±8．122．3±5．2LPS858．4±51．3a106．6±12．8a486．8±26．4aSCT 0．1mmol/kg858．4±51．396．5±9．7902．4±44．2bc 0．5mmol/kg476．2±18．2bc62．5±10．7b752．6±36．2bc 1．0mmol/kg465．6±29．4bc45．3±8．2bc978．5±25．6bcSnPP+SCT(1．0mmol/kg)785．4±33．6b78．1±6．5b589．1±37．5b

与对照组相比，a：P<0.05；与LPS组相比，b：P<0.05；与SnPP+ SCT相比，c：P<0.05

2.6 SCT对肺组织病理变化的影响LPS所致的ALI以水肿和炎性细胞浸润为主要特征。光学显微镜结果表明，肺脏正常组织学评分为1。注射LPS后不仅引起肺泡间质弥漫性水肿，同时引起肺泡含气空间明显减少，其组织学评分为5。1.0 mmol/kg SCT处理LPS大鼠后，肺组织学评分降低至3分(图5)。

图5 SCT对肺组织病理变化的影响(200×)

3 讨 论

SCT是从唇形科黄芩属和菊科飞蓬属植物中分离出的一种黄酮类成分，药理学研究表明，它具有扩张血管、抗血小板以及抗氧化应激损伤等效应[5]。本研究采用不同浓度SCT处理ALI大鼠后，发现它能降低ALI大鼠血浆中TNF-α和IL-6的浓度。IL-6是一种促炎细胞因子，它在启动炎症反应和休克早期高凝状态发挥至关重要作用。在ALI发生的过程中，肺组织水肿和炎性细胞浸润是其主要特征，本研究也发现SCT处理后，可显著减轻肺泡间质弥漫性水肿程度，增加病理学评分，这表明SCT能有效改善ALI大鼠的局部炎症反应程度。本研究同时也发现SCT能增加IL-10的水平。IL-10对炎症具有抑制作用，它能负向调控微生物所致的感染性休克[9-10]。IL-10的另一个重要生物学作用是能上调HO-1的表达。本研究也发现，SCT处理后，不但能上调其mRNA和蛋白表达水平，也能提高其酶活性。HO-1主要是通过其代谢产物来发挥作用。CO和胆绿素不仅可抑制巨噬细胞中iNOS的转录表达和TNF-α生成，同时也能增加抗炎性细胞因子IL-10的表达，形成正反馈而调控炎症反应。如有研究显示给予HO-1诱导剂CoPP能明显抑制TNF-α和HMGB1的表达，从而缓解LPS所致ALI的病情[11]。此外，HO-1缺陷型小鼠IL-10水平降低，但IL-6产生增加，并且对内毒素的敏感大大增强[12]。这些结果证明HO-1能负向调节IL-6、正向调节IL-10的分泌，从而减少内毒素所致器官损伤。本研究也证实，SCT处理后，大鼠肺组织中HO-1的表达水平明显增高，而采用其抑制剂SnPP处理后，可明显消除SCT对TNF-α和IL-6分泌的抑制作用，这表明SCT最终可能通过上调HO-1的表达而参与其对ALI的保护作用。

HO-1受多重机制调控，包括丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C、活性氧、PI3K和核转录因子Nrf2等[13-14]。PI3K是由p85、p55和p110等亚基组成的一种复合体。其中p85α亚基为调节亚基，其磷酸化后可激活下游蛋白激酶B(即Akt)而发挥多种生物学效应。本研究证实SCT处理后能明显诱导p85磷酸化，表明SCT能激活PI3K。活化的PI3K的另一作用就是激活核转录因子Nrf2。细胞在静息条件下，Nrf2与其抑制因子keap1结合并定位于细胞浆内。多种外源性刺激可诱导keap1降解，Nrf2随之转位至细胞核内，并能与HO-1的启动子上游结合而诱导其表达[15-17]。本研究也证实SCT处理可诱导Nrf2核转位，与肺组织中HO-1蛋白表达的趋势一致，这表明Nrf2的激活是诱导HO-1表达的机制。总之，本研究证实SCT能有效改善LPS所致的ALI，其细胞保护作用可能归因于其影响细胞因子的分泌，并激活PI3K/Nrf2通路并诱导HO-1表达有关。

[1] Bosmann M,Ward PA.Protein-based therapies for acute lung injury:targeting neutrophil extracellular traps[J].Expert Opin Ther Targets,2014,18(6):703-714.

[2] Aschner Y,Zemans RL,Yamashita CM,et al.Matrix metalloproteinases and protein tyrosine kinases:potential novel targets in acute lung injury and ARDS[J].Chest,2014,146(4):1081-1091.

[3] Gulla A,Evans BJ,Navenot JM,et al.Heme oxygenase-1 gene promoter polymorphism is associated with the development of necrotizing acute pancreatitis[J].Pancreas,2014,43(8):1271-1276.

[4] Cao TH,Jin SG,Fei DS,et al.Artesunate protects against sepsis-induced lung injury Via Heme Oxygenase-1 Modulation[J].Inflammation,2015.

[5] Sung NY,Kim MY,Cho JY.Scutellarein reduces inflammatory responses by inhibiting Src Kinase activity[J].Korean J Physiol Pharmacol,2015,19(5):441-449.

[6] Sang Z,Li Y,Qiang X,et al.Multifunctional scutellarin-rivastigmine hybrids with cholinergic,antioxidant,biometal chelating and neuroprotective properties for the treatment of Alzheimer’s disease[J].Bioorg Med Chem,2015,23(4):668-680.

[7] Kung CW,Lee YM,Cheng PY,et al.Ethyl pyruvate reduces acute lung injury via regulation of iNOS and HO-1 expression in endotoxemic rats[J].J Surg Res,2011,167(2):e323-331.

[8] Tang H,Tang Y,Li N,et al.Neuroprotective effects of scutellarin and scutellarein on repeatedly cerebral ischemia-reperfusion in rats[J].Pharmacol Biochem Behav,2014,118:51-59.

[9] Belperio JA,Keane MP,Lynch JP,et al.The role of cytokines during the pathogenesis of ventilator-associated and ventilator-induced lung injury[J].Semin Respir Crit Care Med,2006,27(4):350-364.

[10] Strieter RM,Kunkel SL.Acute lung injury:the role of cytokines in the elicitation of neutrophils[J].J Investig Med,1994,42(4):640-651.

[11] Gong Q,Yin H,Fang M,et al.Heme oxygenase-1 upregulation significantly inhibits TNF-alpha and Hmgb1 releasing and attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J].Int Immunopharmacol,2008,8(6):792-798.

[12] Kapturczak MH,Wasserfall C,Brusko T,et al.Heme oxygenase-1 modulates early inflammatory responses:evidence from the heme oxygenase-1-deficient mouse[J].Am J Pathol,2004,165(3):1045-1053.

[13] Lv H,Yu Z,Zheng Y,et al.Isovitexin exerts anti-inflammatory and anti-oxidant activities on lipopolysaccharide-Induced acute lung injury by inhibiting MAPK and NF-κB and activating HO-1/Nrf2 pathways[J].Int J Biol Sci,2016,12(1):72-86.

[14] Yeh CH,Yang JJ,Yang ML,et al.Rutin decreases lipopolysaccharide-induced acute lung injury via inhibition of oxidative stress and the MAPK-NF-κB pathway[J].Free Radic Biol Med,2014,69:249-257.

[15] Zhang Z,Cui W,Li G,et al.Baicalein protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity through activation of Keap1/Nrf2/HO-1 and involving PKCalpha and PI3K/AKT signaling pathways[J].J Agric Food Chem,2012,60(33):8171-8182.

[16] Jaiswal AK.Nrf2 signaling in coordinated activation of antioxidant gene expression[J].2004,36(10):1199-1207.

[17] Kaspar JW,Niture SK,Jaiswal AK.Nrf2:INrf2 (Keap1) signaling in oxidative stress[J].2009,47(9):1304-1309.

ScutellareinReducesLPS-inducedAcuteLungInjuryviaRegulationofPI3K/Nrf2/HO-1inEndotoxemicRats

WANG Biao,YUAN Na,ZHANG Yonghu,et al
(DepartmentofEmergency，theSecondAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China))

ObjectiveTo observe the molecular mechanism of Scutellarein-induced heme oxygenase 1 (HO-1) expression in endotoxemic acute lung injury rat.MethodsRats were administered LPS (30 mg/kg) by intravenous infusion to induce ALI.Scutellarein (0.1,0.5 and 1.0 mmol/kg) was given 1 h after LPS initiation.Expression of HO-1 mRNA and protein in lungs were detected by real time PCR and Western blot,respectively.The enzymic activity of HO-1 was detected by colorimetric method;The tissue injury was analyzed by histopathology.Phosphorylation of PI3K and nuclear translocation of Nrf2 were measured by Western blot.The content of TNF-α,IL-6 and IL-10 were measured by ELISA in serum.ResultsLPS caused a slight HO-1 induction both at the mRNA and protein level,whereas administration of Scutellarein significantly induced higher HO-1 expression and enzymic activity,as compared with the LPS group.In addition,Scutellarein could also induce PI3K phosphorylation and Nrf2 nuclear translocation.Furthermore,0.5 and 1.0 mmol/kg of Scutellarein could attenuate plasma levels of TNF-α and IL-6,and further increased IL-10 levels compared with the LPS group.However,the beneficial effects of Scutellarein on cytokines expression were reversed by HO-1 inhibitor SnPP.ConclusionsScutellarein induces acute lung injury of endotoxemic rat expression of heme oxygenase-1 by activation of PI3K/Nrf2 pathway.

Scutellarein; acute lung injury; hemeoxygenase-1

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.012

2016-03-28；

2016-06-27

*通讯作者，E-mail：359503318@qq.com.

结果LPS注射后肺组织中HO-1 mRNA和蛋白表达水平有所增加，而SCT处理后能进一步上调HO-1表达水平，并能增强其酶活性。同时，SCT也可促进PI3K磷酸化，并能诱导转录因子Nrf2核转位。此外，0.5和1.0 mmol/kg的SCT能减少大鼠血浆中TNF-α和IL-6含量，并能进一步增加IL-10水平。HO-1抑制剂SnPP处理后可消除SCT对细胞因子的影响。结论SCT可能通过激活PI3K/Nrf2诱导HO-1表达来减轻LPS所致炎症反应。

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