EBERs对鼻咽癌转移的作用及其机制研究

程世越，李智，卢建红，左埒莲

（1.中南大学湘雅医院分子医学研究中心，湖南 长沙 410008；2.中南大学肿瘤研究所，湖南 长沙 410078）

论著

EBERs对鼻咽癌转移的作用及其机制研究

程世越1，李智1，卢建红2，左埒莲2

（1.中南大学湘雅医院分子医学研究中心，湖南 长沙 410008；2.中南大学肿瘤研究所，湖南 长沙 410078）

目的探讨EBERs对鼻咽癌转移的作用及其机制。方法在鼻咽癌细胞中转染EBERs，荧光定量PCR（RT-PCR）检测细胞中转移相关指标（如MMP）的相对表达量，同时Transwell检测EBERs对鼻咽癌细胞迁移能力的影响。构建敲除EBERs的BAC-EBV（p2089）质粒，转染鼻咽癌细胞，检测细胞的转移能力。转染EBERs后Western blot检测上皮间质转化（EMT）相关指标，免疫荧光检测ZO-1的表达。结果鼻咽癌细胞转染EBERs质粒或p2089质粒后，RT-PCR检测发现转移相关指标表达升高，Transwell检测结果显示细胞迁移能力增强，而在干扰EBERs或转染敲除EBERs的p2089质粒后，转移能力减弱。转染EBERs后E-cadherin表达降低，Vimentin升高，同时免疫荧光检测发现ZO-1表达降低。结论EBERs可能通过促进EMT高表达而促进鼻咽癌的转移。

EBERs；鼻咽癌；转移；上皮间质转化

EBV属于人嗜淋巴γ疱疹病毒，在人群中的感染率高达95%，与鼻咽癌（NPC）、胃癌、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤有较强的相关性。EBV能够合成2种非编码RNA（EBERs）即EBER1和EBER2，分别由167和172个核苷酸组成，它们是在EBV感染多种细胞（淋巴细胞、鼻咽或胃上皮细胞）后的3个潜伏期中表达量最高的转录本，丰度高达107/细胞[1]，临床上可以作为检测EBV感染的指标[2]。EBERs在EBV感染的细胞中普遍存在，但其在体内的生物学功能却较为复杂，已有报道证实，EBERs能够促进淋巴瘤的发生、发展，但其在其他包括鼻咽癌在内的相关肿瘤中的功能仍不明确。鼻咽癌是一种具有高发病率和致死率的头颈部肿瘤，在流行地区被证实均有EBV的感染。有研究证实，鼻咽癌的发生与EBERs有一定相关性[3]，但并未明确二者之间的因果关系。本研究旨在探讨EBERs是否能够促进鼻咽癌细胞的转移及其作用机制，为鼻咽癌临床治疗提供新的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞系

鼻咽癌细胞系CNE1、HNE1、6-10B、C666-1培养于含10%胎牛血清的RPMI（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），并加入100 u/ml青霉素和100 u/ml链霉素。

1.2 质粒构建

pcDNA3.1-EBERs 10拷贝质粒由本实验室构建和保存，BAC质粒、含EBV B95-8株全基因组的BAC质粒（BAC-EBV）p2089由德国GSF国家环境与卫生研究中心的Hammerschmidt教授惠赠，p2089敲除EBERs质粒的构建流程如下[4-5]。

1.2.1 引物设计EBER1同源重组正向引物：CCC AAGCTTGACGTAGTCTGTCTTGAGGAAGGCTGGAG CTGCTTCGAA，反向引物：CGGAATTCATCCTAAAA CAAAAGTTTGGTCTAGAGTCGACCTGCAGTTCG；E BER2同源重组正向引物：CCCAAGCTTTAGAGTTA CGGTTCGCTACAAGGCTGGAGCTGCTTCGAA，反向引物：CGGAATTCGTGGGTGCAAAACTAGCCACTCT AGAGTCGACCTGCAGTTCG。

1.2.2 电转化感受态细菌的准备首先将表达重组蛋白redαβγ的温敏质粒pKD46按化学方法转化至含p2089质粒的大肠杆菌中，得到p2089-pKD 46细菌，30℃培养，具有氯霉素（Cam）和氨苄青霉素（Amp）抗性，将该细菌制备电转化感受态细胞。

1.2.3 EBERs重组片段的线性转化将纯化的EBERs重组PCR片段100 ng电转化至BAC-pKD46感受态细胞中，30℃、180 r/min培养2 h，离心后将菌液涂板与含卡那霉素（Kan）的LB培养板上，30℃培养过夜后37℃继续培养24 h，将具有Kan抗性的菌落在含有Kan和Cam的LB培基中42℃培养24 h以消除pKD46质粒。

1.2.4 切除重组体中的Kanr基因将重组后线性转化的细菌制成感受态细胞，将表达重组蛋白FLP的温敏质粒pCP20转化至感受态中，在含有Amp的LB培养板上30℃培养48h，挑取菌落至含Cam的LB培基中，42℃培养以消除pCP20，将只有Cam无Kan和Amp的菌液在含有Cam的LB培养板上培养以纯化细菌。

1.3 Transwell迁移实验

实验使用8 μm孔径的24孔板Transwell小室（Coring，NY，USA）。提前将Transwell小室预冷，在上室中加入100μl稀释的Matrigel（用RPMI 1640稀释10倍，BD Biosciences，San Diego，CA），4℃静置10min后将Matrigel吸走，37℃放置1h。细胞消化计数后将3×104个细胞重悬于200 μl无血清培基中并加入上室，下室加入700 μl完全培养基。37℃培养48h后取出小室，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色后进行细胞计数。

1.4 荧光定量PCR

鼻咽癌细胞按照Trizol法提取RNA，使用Prime Scrip RT reagent kit with gDNA Eraser（TaKaRa& Clontech，Japan）进行逆转录，荧光定量PCR根据CFX-96 PCR系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）要求配制反应体系（见附表）。

附表引物及siRNA序列

续附表

1.5 Western blot

细胞加入适量蛋白裂解液RIPA，冰上裂解30 min，4℃离心10 629 r/min离心15 min，BCA法测蛋白浓度按照Thermo Pierce公司的说明书进行操作。将蛋白变性，上样进行SDS-PAGE电泳分离，再将蛋白电转至PVDF膜上，5%牛奶室温封闭1 h，将一抗E-cadherin、Vimentin、Tubulin（Cell Signaling Technologies，Danvers，MA，USA）4℃孵育过夜，第2天二抗室温孵育1 h，用Pierce公司的发光液对膜上蛋白显影，Biorad成像仪成像分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 18.0和Graph Pad Prism 5.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间数据比较用t检验，t检验为双侧检验，Transwell的相对细胞数用Image J 4.2进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽癌细胞转染EBERs后转移能力增加

EBERs表达质粒转染EBV阴性的鼻咽癌细胞CNE1-con、6-10B-con和HNE1-con 48 h后，Transwell检测细胞的侵袭能力发现，EBERs能够增强鼻咽癌细胞的侵袭能力（见图1A）。同时通过比较细胞生长曲线发现，EBERs对鼻咽癌细胞的增殖能力无明显影响（见图1B）。

2.2 敲除EBERs的p2089质粒构建

设计并利用EBER1和EBER2敲除引物从pKD13质粒上PCR扩增两侧带有FRP重组位点的Kanr基因，琼脂糖凝胶电泳证实携带有EBER两侧同源臂的Kanr基因扩增成功（见图2A）。该片段电转化至携带有EBV质粒p2089和同源重组酶表达质粒pKD46的大肠杆菌BAC-46，Kan筛选后经PCR检测证实EBER被成功敲除（见图2B）。进一步转化pCP20质粒去除Kanr基因，Kanr基因引物进行PCR鉴定，证实Kanr基因已经从重组质粒上切除（见图2C）。

2.3 EBERs促进鼻咽癌细胞转移相关基因的表达

鼻咽癌细胞转染EBERs 48 h后PCR检测发现EBERs可以促进ITGB3在CNE1和HNE1中的表达，MMP2在CNE1和HNE2中的表达，以及MMP13在CNE1、HNE1和HNE2中的表达（见图3A）。在EBV阳性的鼻咽癌细胞C666-1中用siRNA干扰EBER1和EBER2（siRNA序列见附表），PCR检测结果可以看出ITGB3、MMP2、MMP13降低（见图3B），从而反向验证EBERs具有促进鼻咽癌转移的作用。

图1 EBV阴性鼻咽癌细胞瞬转EBERs后细胞的迁移和增殖能力

图2 从p2089质粒成功切除EBERs基因

在EBV阴性的鼻咽癌细胞CNE2中转染p2089及敲除EBERs的p2089质粒，48 h后PCR检测转移相关基因的表达，可以观察到MMP2、MMP3、MMP9在转染p2089后升高，而敲除EBERs后则抑制p2089质粒对MMP2、MMP3、MMP9基因表达的上调（见图3C）。

2.4 EBERs促进鼻咽癌细胞的上皮间质转化

EBV阴性的6-10B细胞中转染EBERs后，细胞形态由短小的椭圆形变成周围有细长角的不规则形，且细胞之间的黏附变得松散（见图4A），这种形态改变被认为是上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的典型过程。Western blot验证EMT相关分子的变化（见图4B），发现EBERs的表达使得E-cadherin降低，Vimentin升高，同时免疫荧光检测结果显示ZO-1的表达低于对照组（见图4C）。

图3 EBERs促进鼻咽癌细胞转移相关基因的表达（±s）

图4 EBERs促进鼻咽癌细胞6-10B的EMT表型和相关基因表达

3 讨论

鼻咽癌在我国南方高发，EBV是鼻咽癌的致病因素之一。EBERs是EBV编码的非翻译RNA在EBV潜伏感染阶段丰度最高的转录本，具有独特的二级茎环结构。自1981年首次发现EBERs以来，EBERs的研究重点主要在其二级结构、结合蛋白，以及对细胞的转化功能，潜伏致癌性[6]，但EBERs的具体功能仍不明确。EBERs在EBV致病的传染性单核细胞增多症以及一些EBV相关的肿瘤如鼻咽癌、胃癌、淋巴瘤中表达[7]，早在90年代日本研究团队已经证实，EBV可以促进Burkitt淋巴瘤细胞Akata的发生、发展以及增加抗凋亡能力，其后他们又进一步证实，EBERs对Akata细胞的这些改变也同样产生作用[8]，在EBV阴性的Akata细胞中过表达EBERs，细胞软琼脂克隆形成能力、抗凋亡能力增强，癌基因Bcl-2升高，并且认为EBERs的这些功能可能与PKR相关。此后，EBERs对肿瘤的相关功能研究也逐渐增多，但主要是针对淋巴瘤进行探讨，对鼻咽癌、胃癌的研究较少。

EBERs与鼻咽癌的相关性研究较少且不深入，早期有研究表明EBERs可以作为鼻咽癌转移的一个分子指标[9]，而较近的研究通过鼻咽癌临床样本实验分析[10]，提示EBERs的高表达可能作为鼻咽癌预后较好的一个指标，与之前的结论相互矛盾。因此，EBERs在鼻咽癌中发挥何种功能至今没有明确结论。本研究从细胞层面探讨EBERs是否能够促进鼻咽癌细胞的转移。笔者在鼻咽癌细胞中瞬时转染EBERs，观察到鼻咽癌的侵袭转移能力增强，但是对其增殖没有明显影响，PCR检测表明转移相关基因MMP2、MMP3等均显著上升，同时在C666-1细胞中通过干扰EBERs反向验证以上结论。为了进一步验证EBV基因组中的EBERs对鼻咽癌的作用，笔者引入EBERs敲除的p2089质粒，瞬时转染鼻咽癌细胞，同样证实EBERs能够促进鼻咽癌细胞的转移能力及转移相关基因的表达。

发生转移的肿瘤细胞需脱离相邻的细胞而进入周围环境中，这需要肿瘤细胞失去细胞-细胞间黏附并获得极性，其中EMT在肿瘤转移中起着重要作用。发生EMT时上皮细胞向可游离的间质细胞转化，细胞形态由鹅卵石样向梭形转变，细胞分子发生改变。肿瘤细胞发生转移可由EMT介导的结论在过去的研究中已经很明确，例如RU等[11]研究的miRNA-29b可以通过抑制EMT从而抑制前列腺癌的转移；EMT在鳞状细胞癌的转移中起着重要的作用[12]。通过实验证实鼻咽癌细胞系6-10B瞬转EBERs后形态发生改变，与EMT的经典表型一致，通过Western blot及免疫荧光进一步验证EBERs能够促进EMT相关分子的表达。

综上所述，EBERs能够促进鼻咽癌的侵袭转移，并且该过程可能是通过EMT介导，本结果将为鼻咽癌抗复发和转移的临床治疗提供新的潜在靶点。

[1]LEE N,MOSS W N,YARIO T A,et al.EBV noncoding RNA binds nascent RNA to drive host PAX5 to viral DNA[J].Cell,2015, 160(4):607-618.

[2]BANERJEE A S,PAL A D,BANERJEE S.Epstein-Barr virusencoded small non-coding RNAs induce cancer cell chemoresistance and migration[J].Virology,2013,443(2):294-305.

[3]BURKE A P,YEN T S,SHEKITKA K M,et al.Lymphoepithelial carcinoma of the stomach with Epstein-Barr virus demonstrated by polymerase chain reaction[J].Mod Pathol,1990,3(3):377-380.

[4]卢建红,唐运莲,周鸣,等.在基于BAC的EB病毒基因组中引入突变[J].微生物学报,2008,48(3):385-390.

[5]GREGOROVIC G,BOSSHARD R,KARSTEG C E,et al.Cellular gene expression that correlates with EBER expression in Epstein-Barr virus-infected lymphoblastoid cell lines[J].Journal of Virology,2011,85(7):3535-3545.

[6]YOSHIZAKI T,ENDO K,REN Q,et al.Oncogenic role of Epstein-Barr virus-encoded small RNAs(EBERs)in nasopharyngeal carcinoma[J].Auris Nasus Larynx,2007,34(1):73-78.

[7]KITAGAWA N,GOTO M,KUROZUMI K,et al.Epstein–Barr virus-encoded poly(A)(-)RNA supports Burkitt's lymphoma growth through interleukin-10 induction[J].EMBO J,2000,19(24): 6742-6750.

[8]KOMANO J,MARUO S,KUROZUMI K,et al.Oncogenic role of Epstein-Barr virus-encoded RNAs inBurkitt's lymphoma cell line akata[J].Journal of Virology,1999,73(12):9827-9831.

[9]CHAO T Y,CHOW K C,CHANG J Y,et al.Expression of Epstein-Barr virus-encoded RNAs as a marker for metastatic undifferentiated nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer,1996,78(1): 24-29.

[10]KE K J,WANG H Y,FU S,et al.Epstein-Barr virus-encoded RNAs as a survival predictor in nasopharyngeal carcinoma[J]. Chinese Medical Journal,2014,127(2):294-299.

[11]RU P,STEELE R,NEWHALL P,et al.miRNA-29b suppresses prostate cancer metastasis by regulating epithelial-mesenchymal transition signaling[J].Mol Cancer Ther,2012,11(5):1166-1173.

[12]TSAI J H,DONAHER J L,MURPHY D A,et al.Spatiotemporal regulation of epithelial-mesenchymal transition is essential for squamous cell carcinoma metastasis[J].Cancer Cell,2012,22(6): 725-736.

（申海菊 编辑）

EBERs promote metastasis of nasopharyngeal carcinoma via epithelial-mesenchymal transition

Shi-yue Cheng1,Zhi Li1,Jian-hong Lu2,Lie-lian Zuo2
(1.Center for Molecular Medicine,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha, Hunan 410008,China;2.Cancer Research Institute,Central South University, Changsha,Hunan 410078,China)

Objective To investigate whether EBV encoded RNAs(EBERs)could promote metastasis of nasopharyngeal carcinoma(NPC)and the possible involvement of epithelial-mesenchymal transition(EMT)in this process.Methods EBERs expression plasmid was transfected into EBV negative NPC cell lines with lipofectamine 2000.48 h after transfection,matrigel migration assay and cell counting were conducted to explore the impact of EBERs on NPC migration and proliferation,respectively.In addition,siRNA targeting EBERs was applied to EBV positive C666-1 cells,after that the expression changes of metastasis related genes were detected.To consolidate the observation,EBERs-deleted EBV expression plasmid was contructed based on bacterial artificial chromosome(BAC)system.Then expression changes of metastasis related genes were compared between the cells harboring EBV with or without EBERs.Futhermore,the involvement of EMT associated genes in EBERs-mediated metastasis was explored via Western blot,and immunofluorescence was used to detect ZO-1 expression.Results Transient transfetion of EBERs significantly improved metastasis of NPC cells and expression of metastasis related genes.However,EBERs had no impact on NPC cell proliferation.In support of the observation,siRNA targeting EBERs or EBERs deletion significantly decreased expression of metastasis related genes.Furthermore,EBERs expression decreased ZO-1 and E-cadherin expressions while increased Vimentin expression.Conclusions EBERs could promote metastasis of NPC cells,and EMT probably contributes to this process.

EBERs;nasopharyngeal carcinoma;metastasis;EMT

R739.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.005

1005-8982（2016）23-0021-06

2016-08-30

李智，E-mail：peries@163.com；Tel：15802654231