制粉和分层研磨对小麦中赭曲霉毒素A的去除效果

彭春红 王 丽 安凤平 李淑荣 罗红霞 王 强

(北京农业职业学院食品生物技术学院1，北京 102442)

(福建农林大学食品科学学院2， 福州 350002)

(农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室 中国农业科学院农产品加工研究所3，北京 100193)

制粉和分层研磨对小麦中赭曲霉毒素A的去除效果

彭春红1,2,3王 丽1安凤平2李淑荣1罗红霞1王 强3

(北京农业职业学院食品生物技术学院1，北京 102442)

(福建农林大学食品科学学院2， 福州 350002)

(农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室 中国农业科学院农产品加工研究所3，北京 100193)

以人工染菌的小麦为原料，对小麦进行扫描电镜观察、制粉和分层研磨，分析小麦中赭曲霉菌丝体的分布规律以及加工工艺对赭曲毒素A(OTA)的去除效果。结果发现，赭曲霉菌丝体主要依附在小麦两端的表皮上，并逐步向内延伸。OTA含量为2.26～185.4 μg/kg的小麦制得的小麦粉中OTA含量减少了50%～68%。麸皮和细麸中OTA平均总量之和约为72.75%，OTA主要分布于小麦的麸皮和细麸中，而在胚乳中则很少。通过检测小麦经分层碾磨设备后各样品的OTA含量，发现分层研磨可以有效去除小麦中的OTA毒素。经3次研磨后，脱皮率约为18%，脱皮小麦中OTA的含量减少了44%～63.06%。在制粉和分层研磨过程中并没有促进OTA的生成或消除，只是对其进行重新分布。

小麦 OTA 制粉 分层研磨 去除

赭曲霉毒素A(Ochratoxin)是主要由赭曲霉(Alochraceus)、纯绿青霉(Plverrucosum)和碳黑曲霉(Alcarbonarius)产生的一种真菌次级代谢产物，具有致癌、致畸和致突变性，以及强烈的肾毒性、肝脏毒性、神经毒性和免疫毒性[1-2]。OTA是小麦贮藏中最常见的真菌毒素之一，在小麦生长后期以及收获后的加工、贮存、运输等各个环节中很容易被其污染[3]。调查显示，我国小麦及其制品中存在着不同程度的OTA污染。谈敦芳[4]对我国6个不同省区的128份小麦样品进行了调查，OTA的检出率为12.43%，最大污染水平为1.47 μg/kg。杨家玲[5]对我国主要食品中OTA污染水平的研究发现，51个挂面样品中有6个样品超过国家限量标准5 μg/kg。食用被真菌毒素污染的小麦及其制品，可造成急性或慢性毒性，危害人类健康[6]。中国作为一个以植源性食物为主的国家，特别是在北方主要以面制品为主食，潜在危害就更大[7]。因此，寻找有效降低OTA进入面制品乃至食物链机率的方法显得越来越迫切。

目前，物理方法是脱除真菌毒素的主要手段之一。吸附、热处理、漂洗、γ-射线等方法对真菌毒素都有一定的脱除效果[8]，但是这些方法会破坏小麦的营养物质以及产生二次污染，而加工处理不仅能去除真菌毒素，还能保持小麦的营养物质。国内外有很多关于加工去除小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON，亦称呕吐毒素)的研究。通过制粉，小麦粉中DON的含量降低了79%～90%[9]。分层研磨和剥皮工艺也可有效去除小麦中DON毒素[10-12]。剥皮处理去除了大部分集中在小麦表皮的细菌、农药残留、重金属残留和灰尘，不但大大提高了食品的安全性，而且缩短了粉路，提高了出粉率，降低了动力消耗，在一定程度上提高了小麦粉产品的商业价值[12-14]。受不同含量水平OTA污染的小麦加工成的馒头、面条是否可以作为安全的食品为人们食用是亟需解决的问题[3]。国内外关于小麦中OTA的分布规律以及加工去除的研究较少，本研究以不同污染程度的小麦为原料，探索小麦中OTA在加工过程中降解以及转移规律，控制加工链中的OTA毒素，为小麦制品的食用安全提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦：北京农贸市场；OTA标品：新加坡Pribolab公司；乙腈、甲醇、乙酸(色谱级)：美国Fisher公司。

1.2 仪器与设备

SL-100型高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金厂；PriboFast赭曲霉毒素免疫亲和柱：新加坡Pribolab公司；Prominenece UFLC高效液相色谱仪：日本岛津公司； S-70型扫描电子显微镜：日本日立公司；LRMM8040-3-D试验磨粉机、LFS-30粉筛：无锡锡粮机械制造有限公司；JNMJ-3型检验碾白机：台州市新恩精密粮仪有限公司；60Co源：中国农业科学院农产品加工研究所。

1.3 试验方法

1.3.1 小麦染菌

小麦浸泡过夜，含水量达到25%左右，10 kGy下进行辐照杀菌处理。将10 mL浓度为106CFU/mL的赭曲霉菌液接种到350 g小麦中，置于28 ℃恒温培养箱中培养。在第3天、第5天和第7天取样，分别记为小麦A、小麦B和小麦C。在50 ℃条件下烘干，测定小麦中OTA的含量。小麦A、B、C中OTA的含量分别为2.26、10.56、185.40 μg/kg。

1.3.2 扫描电镜观察小麦上赭曲霉菌丝体分布规律

小麦用植物固定液室温下固定48 h，将小麦放入临界点干燥器样品室，进行CO2临界点干燥，将制好的干燥样品用锋利的双面刀切成0.2 mm厚的薄片，然后粘到导电性好的黏合剂样品台上，采用离子溅射镀膜机喷金后，进行扫描电镜观察。

1.3.3 制粉工艺

对小麦样品进行清理，去除样品中的杂质。采用105 ℃恒重法对小麦的含水量进行测定。然后将500 g清理后的小麦与润麦所需的加水量放入聚丙烯桶中混合20 min，将桶密封24 h，使磨粉前小麦的含水量达到14.5%左右。将备好的小麦放入磨粉机内进行研磨，得到麸皮、细麸、皮磨粉和心磨粉4个组分。

1.3.4 小麦的分层研磨工艺

取小麦100 g进行研磨，分5批进行，每批研磨3次，碾磨时间60 s。研磨完后，取出料斗，收集表皮。为了减少组间差异，将每批得到的表皮和脱皮小麦统一收集。检测OTA的含量，重复3次，取3组平均值。

1.3.5 OTA的提取与净化

1.3.5.1 溶液的制备

提取液：甲醇与水的体积比为80∶20；PBS缓冲液：称取8 g氯化钠，1.2 g磷酸氢二钠，0.2 g磷酸二氢钾，0.2 g氯化钾，用990 mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1 000 mL。

1.3.5.2 OTA提取

样品用高速万能粉碎机磨碎至通过20目筛。准确称取5 g置于100 mL的三角瓶中，加入40 mL提取液，振荡提取1 h。经定性滤纸快速过滤，备用。取10 mL滤液于50 mL溶液瓶中，用PBS缓冲稀释至刻度，经玻璃纤维滤纸过滤，备用。

1.3.5.3 OTA净化

将赭曲霉毒素免疫亲和柱连接于10 mL注射器下端。准确移取10 mL提取液于注射器中，调节压力使提取液以2～3 mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，再用10 mL的PBS缓冲液清洗1次，弃去全部流出液，以2～3 mL/min的流速缓慢通过免疫亲和柱。用2 mL流动相进行洗脱，收集洗脱液，过0.2 μm滤膜，取1 mL洗脱液，供高效液相色谱测试时使用。

1.3.6 OTA检测

采用高效液相色谱法(HPLC)对OTA进行测定。

检测条件：色谱柱为C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水-乙酸溶液(99∶99∶2，体积比)；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样体积为20 μL；420型荧光检测器激发波长333 nm，发射波长477 nm。

标准曲线制备：取2、 5、10、 25、50、100、200 ng/mL OTA系列标准工作液，按HPLC的条件进样，绘制标准曲线，采用外标法定量。在2～200 ng/mL浓度范围内，色谱峰面积与OTA浓度成典型的线性关系，线性回归方程y=10 583x-441.33，式中：y为峰面积；x为浓度；R2=0.999 9。

1.4 试验数据处理

采用OriginPro 7.5对试验测得的数据进行方差分析和显著性测验，其中显著性测验采用t检验，取P=0.05。测定重复次数n=3。

2 结果与分析

2.1 染菌小麦上赭曲霉菌丝体分布规律

采用扫描电镜观察染菌小麦籽粒横切面上赭曲霉菌丝体分布规律(图1)，可以看到未染菌小麦表面无菌丝体附着，内部保持小麦固有的状态(图1a)。染菌3 d后，有少量赭曲霉菌丝体紧密依附在小麦表皮外侧，且有从外向内延伸的趋势(图1b)。染菌7 d后，在小麦的表皮内侧和外侧均有赭曲霉菌丝体的存在，且主要存在于小麦的顶端(图1c)，原因在于小麦顶端是胚芽、水分和营养物质含量较其他部位高。随着培养时间的延长，赭曲霉菌丝体从表面逐渐向内部延伸，侵染胚乳。小麦中赭曲霉菌丝体分布规律与小麦中DON菌丝体的分布规律相同[15]。

图1 小麦籽粒横切面扫描电镜图

2.2 小麦制粉过程中OTA含量的变化

制粉是将小麦中OTA的含量重新进行分布的一个过程。对3种不同污染程度的小麦进行研磨制粉，得到麸皮、细麸、皮磨粉和心磨粉4个组分，各组分OTA浓度如表1所示。由表1可知，高、中、低不同污染程度的小麦中OTA浓度分别为185.40、10.56和2.26 μg/kg，污染小麦制粉后与全麦相比，各组分中OTA浓度发生了明显的变化。麸皮和细麸中OTA的浓度显著升高(P<0.05)，分别为全麦中OTA浓度的1.67～1.91倍和2.10～2.42倍。细麸中OTA浓度明显高于麸皮，可能是由于细麸的主要成分是胚芽，易受赭曲霉侵染。皮磨粉和心磨粉中OTA的浓度显著降低(P<0.05)，均仅为全麦中OTA浓度的50%左右，且皮磨粉中OTA的浓度略高于心磨粉，进一步说明由外至里污染程度逐层降低。类似的研究表明，通过制粉可以去除OTA含量较高的麸皮和细麸，制得的小麦粉中OTA的含量仅为全麦的25%～33%[16]。本试验中，中、低OTA含量小麦制得的小麦粉中(心磨粉和皮磨粉)OTA平均浓度分别为3.47和1.11 μg/kg，低于国家限量标准5 μg/kg。而高OTA含量小麦制得的小麦粉中(心磨粉和皮磨粉)OTA平均浓度为86.36 μg/kg，显著高于国家限量标准(5 μg/kg)。因此，在清理的过程中，必须重视对高OTA含量小麦的清理。

表1 小麦制粉各组分OTA浓度的变化

注：数据是平均值±标准值；a, b, c, d表示数据在P<0.05水平下呈显著相关性， 余同。

高、中、低OTA含量小麦制粉后各组分中OTA的含量(组分中OTA浓度×组分质量)所占比例分布情况如图2所示。分析图2可知，污染浓度对各组分中OTA含量所占的比例没有明显的影响，麸皮中OTA的平均含量所占比例为(41.39±4.09)%、细麸(31.36±2.73)%、皮磨粉(6.88±1.47)%和心磨粉(18.95±3.69)%。麸皮和细麸中OTA平均含量的总和为72.75%左右，可见OTA主要存在于小麦纤维含量较高的果皮和种皮中[17]。小麦粉中OTA的含量则相对较少(25.83%)，其残留量与真菌侵入胚乳的程度有关[18]。各个组分中OTA含量的总和为98.58%左右，与全麦中OTA的含量大致相等，只有1.42%的损失。OTA在小麦中的分布规律与其它真菌毒素类似[5]。然而，Zhang等[9]对含DON的小麦进行制粉，发现各组分中DON含量的总和比全麦中DON的含量减少了30%～40%。因为在研磨过程中，温度升高，DON与小麦中的成分发生作用，导致DON的结构发生变化，使得DON的含量减少[5]。而OTA对热很稳定，在制粉过程中结构没有发生变化，因此，OTA总含量没有减少。虽然小麦中OTA的总含量没有减少，但制粉可以去除OTA含量较高的麸皮和细麸，获得OTA含量较低的小麦粉。

图2 小麦制粉各组分OTA所占的比例

2.3 小麦分层研磨过程中OTA含量的变化

高、中、低OTA含量的小麦经过连续3次研磨后，得到3道表皮和脱皮小麦。分别检测样品中OTA的含量，各组分中OTA的浓度随着污染程度的增加而增加(表2)。3种不同OTA含量小麦得到的3道表皮中OTA的浓度均明显高于全麦，表皮1、2、3中OTA的浓度分别为全麦的4.94～5.80倍、2.43～2.69倍、1.61～2.53倍，可以看出小麦表皮中OTA的浓度从外到内逐层降低，差异显著(P<0.05)。脱皮小麦中OTA的浓度明显降低，仅为全麦的36.93%～56.21%。这一结果证明了2.1中电镜下观察的现象，赭曲霉由小麦外层向内层逐渐入侵，因此表皮中的毒素显著高于胚乳。

表2 小麦分层研磨各组分OTA浓度的变化

图3为分层研磨各组分中OTA含量(组分中OTA浓度×组分质量)所占的比例，可以看出污染浓度对各组分中OTA含量所占的比例没有明显的影响。高、中、低OTA含量小麦分层研磨得到的小麦表皮1、表皮2、表皮3和脱皮小麦中OTA的平均含量分别占到小麦中OTA总量的(37.64±3.05)%、(13.31±4.36)%、(10.62±3.11)%和(39.31±7.82)%。可见，OTA主要存在于小麦表皮中，占OTA总量的61.54%。各组分OTA含量的总和(100.81%)与小麦中OTA的含量基本相等。因此在整个分层研磨过程中，并没有促进OTA的生成或消除。

经过3次脱皮，小麦的脱皮率为18%左右，此时小麦皮层(10.6%)和糊粉层(7.65%)都被脱除[16]。脱皮小麦中OTA的残留量随着小麦污染程度的增加而增加。对于污染程度较低的小麦A和小麦B，脱除18%的表皮后，OTA浓度分别降低了49.11%和63.06%，脱皮小麦中OTA的浓度分别为1.15和3.90 μg/kg，显著低于国家限量标准5 μg/kg。对于OTA含量较高的小麦C，脱除18%表皮后，OTA的含量降低了44%，脱皮小麦中OTA的含量为104.22 μg/kg，显著高于国家限量标准5 μg/kg。由此可知，分层研磨可以有效去除OTA含量较低的小麦中的毒素。

图3 小麦分层研磨各组分OTA所占的比例

3 结论

赭曲霉菌丝体主要依附在小麦两端的表皮上，随着时间的延长，逐渐向内部延伸，侵染胚乳。小麦制粉工艺是一种有效去除小麦中OTA毒素的方法，小麦粉中OTA的浓度降低了50%～68%。OTA主要分布于小麦的麸皮和细麸中，总量之和约为72.75%，而在胚乳中则很少。利用分层研磨工艺也可以有效去除小麦中的OTA毒素，经3次研磨制得的脱皮小麦中OTA的浓度降低了44%～63.06%。

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Reduction Effect of Ochratoxin A During Wheat Milling and Dehulling Process

Peng Chunhong1,2,3Wang Li1An Fengping2Li Shurong1Luo Hongxia1Wang Qiang3

(Department of Food and Biological Engineering Beijing Vocational College of Agriculture1, Beijing 102442) (College of Food Science Fujian Agriculture and Forestry University2, Fuzhou 350002) (Key Opening Laboratory of Agricultural Products Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture Institute of Agro-Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences3, Beijing 100193)

The distribution ofAspergillusochraceusin wheat and the reduction of OTA during milling and dehuliing process were investigated with artificial contamination wheat. It was observed thatAspergillusochraceushyphaewere mainly grown on the top and root of the wheat by scanning electron microscope. Ochratoxin are mainly depended on epidermis of two ends of wheat and extend to the inside.The concentration of OTA in flour was decreased by 50%～68% after the wheat with the OTA concentration of 2.26～185.4 μg/kg was milled. The average amount of OTA in bran and shorts accounted for about 72.75% of OTA in wheat, thus it decreased the content of OTA in endosperm. The dehulling process could remove OTA effectively by detecting the OTA in wheat and epidermis collected before and after layered milling. The content of OTA in wheat decreased by 44%～63.06% after about 18% of wheat tissue was removed. It was a redistribution process without OTA transferred or decomposed during milling or dehulling process.

wheat, OTA, milling, dehulling, reduction

TS213.2

A

1003-0174(2016)03-0007-05

国家科技支撑计划(2012BAD29B03)，北京农业职业学院技术研发与示范推广(XY-YF-14-22)

2014-07-24

彭春红，女，1989年出生，硕士，食品加工理论与应用

李淑荣，女，1968年出生，教授，农产品贮藏加工中的品质控制