微生物利用油茶籽油工艺水产碱性蛋白酶初探

苏 悟 郑小芬 徐睿烜 蒋立文 郭 华 周建平

(湖南农业大学食品科学技术学院1，长沙 410128)

(食品科学与生物技术湖南省重点实验室2，长沙 410128)

(湖南省发酵食品工程技术研究中心3，长沙 410128)

微生物利用油茶籽油工艺水产碱性蛋白酶初探

苏 悟1,2郑小芬1,2徐睿烜1,2蒋立文2,3郭 华1,2周建平1,2

(湖南农业大学食品科学技术学院1，长沙 410128)

(食品科学与生物技术湖南省重点实验室2，长沙 410128)

(湖南省发酵食品工程技术研究中心3，长沙 410128)

通过对4种产蛋白酶微生物的筛选，选择具有较高产碱性蛋白酶能力的枯草芽孢杆菌。接种到水酶法提取油茶籽油的工艺水中使其产蛋白酶，并通过产酶条件优化提高蛋白酶产量。在原有产酶培养液配方(酵母浸粉2%、蔗糖1.0%、吐温-80 0.5%、硫酸镁 0.02%、pH 9.0、接种量4%(V/V))的基础上，得到最佳产酶条件为：工艺水预先白土处理2 h，5 000 r/min离心10 min，按80%的比例添加到水中、培养时间96 h，枯草芽孢杆菌在该产酶条件下最高酶活力为34.8 u/mL。

油茶籽油 工艺水 微生物 蛋白酶活力

目前，茶籽油的提取方法主要有压榨法和浸提法，压榨法存在出油率和原料利用率低的问题，而浸提法所用的有机溶剂存在一定的安全隐患。水酶法提取油脂是一种研究较多的油脂制取方式。此法具有条件温和、设备简单、保护环境、油品质高、最大限度保存营养成分等优点[1-2]。目前水酶法提取油茶籽油的研究已取得了一定的成效并实现产业化，但水酶法提油过程中产生的工艺废液的处理技术逐步被人们所关注。

采用水酶法提取油茶籽油后的工艺水为粘稠的浆液，其中含有大量的粗蛋白、碳水化合物和茶皂素等活性功能成分。油茶籽中的大分子糖类，在油脂提取过程中被糖化酶水解为还原糖类，若不及时处理，极易滋生腐败微生物，尤以产酸细菌和霉菌为甚，直接排放将给环境造成污染[3]。油茶籽油提取废水中含有较高的皂素，是一种较好的清洗剂原料，单独提取成本较高，况且目前洗涤剂基本上以蛋白酶和脂肪酶为主，茶籽油工艺水中含有的大量蛋白质、多糖可以被微生物利用，将具有产酶能力的微生物接种到工艺水中，进行蛋白酶、脂肪酶的优化培养，以达到产酶的目的，结合工艺水中的茶皂素，使工艺水具有一定的去污效果，并应用到目前的洗涤产品中，应该是目前处理该类废水较佳途径。

碱性蛋白酶是目前应用较为广泛的一种洗涤产品用酶，微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，同时易于实现工业化大批量生产。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性，有一定的酯酶活力。因此，碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点[4-6]。本研究通过微生物的筛选，选择具有较高产碱性蛋白酶能力的微生物，接种到水酶法提取油茶籽油的工艺水中使其产碱性蛋白酶，并通过产酶条件优化提高蛋白酶产量，为今后油茶籽油工艺水的有效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

1.1.1 原料：新鲜油茶籽油工艺水(蛋白质4%～6%、总糖6%～8%、油脂0.7%[7]、茶皂素0.6%)：湖南农业大学粮食油脂实验室。

1.1.2 菌种：地衣芽孢杆菌(CGMCC20004)，枯草芽孢杆菌(CGMCC23708)，铜绿假单胞菌(CGMCC 20546)：中国微生物菌种保藏管理中心，纳豆芽孢杆菌：湖南农业大学微生物实验室。

1.1.3 培养基：种子培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%；枯草芽孢杆菌产酶培养基[8]：酵母浸粉2%，蔗糖1.0%，吐温-80 0.5%，硫酸镁0.02%，pH 9.0，接种量4%(V/V)；地衣芽孢杆菌产酶培养基[9]：葡萄糖1.5%，豆粕6%，乳糖4%，磷酸铵1.2%， KCl 0.03%，CaCl20.07%，MgSO40.02%，吐温-80 0.05%，pH 9.0,接种量4%(V/V)；铜绿假单胞菌产酶培养基[10]：蛋白胨 1%, 酵母膏 0.5%，氯化钠0.5% (W/V), 吐温-80 0.5%，pH 8.5,接种量5%(V/V)。

纳豆芽孢杆菌产酶培养基[11]：可溶性淀粉3.41%，麸皮2%，黄豆粉2.26%，CaCl20.2%，K2HPO40.24%，吐温-80 0.2%，pH 8.5,接种量4%(V/V)。

1.1.4 试剂：L-酪氨酸：Sigma公司；干酪素、福林酚试剂：国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠，氢氧化钠，硼酸，三氯乙酸，盐酸(分析纯)：广东光华科技股份有限公司。

1.2 主要仪器设备

101-2AB型电热恒温鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机：湘仪离心机厂；SKY-2102恒温摇床：上海速坤仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 4种微生物生长曲线的测定

采用比浊法[12]分别测定枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和纳豆芽孢杆菌生长曲线，方法步骤如下：

菌种活化24 h→接种于培养液中(接种量2.5%)→培养12 h后在波长320～420 nm下进行扫描→得出最大吸收波长。

菌种活化24 h→接种于培养液中(接种量2.5%)→每隔2 h在最大吸收波长下测定吸光度→记录到30 h并绘制生长曲线。

1.3.2 微生物在培养液中碱性蛋白酶活力的测定

根据微生物生长曲线判断不同微生物产酶的最佳时间，将微生物活化液接种于产酶培养液中，在产酶条件下进行培养，测定每种微生物的蛋白酶活力，比较得出产酶活力最高的微生物，作为工艺水利用的微生物菌种。

1.3.3 不同比例工艺水添加对蛋白酶活力的影响

按20%，40%，60%，80%的添加量将工艺水添加到水中，根据微生物产酶培养基配比进行营养化，按最适宜接种量将活化后的微生物液体培养液接入工艺水培养液中，以不添加工艺水的培养液作为对照，在产酶条件下进行培养，测定酶活力，制作蛋白酶活力条形图，进行比较，得出最佳工艺水添加量。

1.3.4 不同方法处理工艺水对蛋白酶活力的影响

对生产后的工艺水分别进行白土处理(添加量6%，室温处理2 h)，活性炭处理(炭层厚度 7.5 cm,室温处理4 h)，硫酸铝处理(添加量0.5%，50 ℃水浴处理2 h)，蛋白质沉淀剂处理(乙酸锌、亚铁氰化钾各5%，70 ℃水浴处理1 h)处理后将工艺水离心(5 000 r,10 min)去下层沉淀，再按产酶培养基配比进行营养化，接种培养，测定酶活力值，比较不同方法处理工艺水后蛋白酶活力值是否有较大提高，并得出最佳的工艺水预处理方法。

1.3.5 不同培养时间蛋白酶活力的变化

按工艺水添加的最佳比例配制产酶培养基，在微生物产酶条件下进行培养，分别在24、48、72、96、120 h测定蛋白酶活力，制作蛋白酶活力变化曲线，判断产酶菌种在工艺水中的最佳产酶时间。

1.3.6 茶皂素对微生物产酶的影响

配制茶皂素0%，0.25%，0.5%，0.75%的浓度梯度，按不同浓度添加到配制好的微生物产酶培养液中，在微生物产酶条件下进行培养，培养到最佳产酶时间后，分别测定不同浓度茶皂素添加量培养液中的蛋白酶活力，分析茶皂素对微生物产酶的影响。

1.4 蛋白酶活力测定[13]

利用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸量(μg)，即为吸光常数K值。应在95～100范围内。将培养一定时间的含菌工艺水或培养液离心(5 000 r/min,10 min)，静置，取上清液液1.0～2.0 mL，稀释一定倍数，推荐浓度为酶活力10～15 u/mL。

2 结果与分析

2.1 4种微生物生长曲线的测定

4种微生物的最大吸收波长在370～400 nm之间，将活化24 h菌悬液接种于工艺水中(接种量2.5%)，每隔2 h在最大吸收波长下测定吸光度，记录到30 h并绘制生长曲线。4种微生物的生长曲线见图1。

由4种微生物的生长曲线可以看出，枯草芽孢杆菌在培养液中培养16 h开始进入稳定期，第22小时达到最大吸光值，地衣芽孢杆菌在生长的14 h进入稳定期，20 h达到最大吸光值，铜绿假单胞菌在培养后12 h达到稳定期，20 h达到最大吸光值。纳豆芽孢杆菌在培养的16 h达到最大吸光值。由于微生物的产酶代谢积累一般是在稳定期末期达到最多，通过4种微生物最大吸光值的判断，初步确定在培养24 h后对其进行酶活力测定。

图1 4种微生物的生长曲线

2.2 4种微生物碱性蛋白酶活力的测定

将4种微生物的活化液分别接种于各自的产酶培养液中，培养条件为：36 ℃，200 r/min，初始pH = 9，培养24 h，测定蛋白酶活力，蛋白酶标准曲线见图2，蛋白酶活力值见图3。

图2 L-酪氨酸标准曲线

根据标准曲线计算K值，得到K=97在允许范围(95～100)内，符合要求。

图3 不同微生物产蛋白酶活力比较

由图3可以看出，4种微生物中，枯草芽孢杆菌产碱性蛋白酶的活性最高，因此选择枯草芽孢杆菌作为工艺水利用的菌种。

2.3 不同比例工艺水添加对蛋白酶活力的影响

按20%，40%，60%，80%的添加量将工艺水添加到水，根据枯草芽孢杆菌的产酶培养基的配比进行营养化，按4%接种量将活化后的微生物液体培养液接入工艺水培养液中，以不添加工艺水的培养液作为对照，在36 ℃，200 r/min产酶条件下进行培养，测定酶活力，蛋白酶活力柱形图见图4。

图4 不同工艺水添加量对蛋白酶活力的影响

图4显示，工艺水的添加不利于枯草芽孢杆菌的产酶，与对照组相比，添加组的蛋白酶活力明显较低，可能是由于工艺水中的茶皂素或油脂导致添加工艺水后酶活力普遍较低。相对来看，80%的添加量的酶活力高于其他添加量，而随着添加比例的上升，酶活力并无明显相关性。

2.4 不同方法处理工艺水对蛋白酶活力的影响

对生产后的工艺水分别进行白土处理(添加量6%，室温处理2 h)，活性炭处理(炭层厚度 7.5 cm,室温处理4 h)硫酸铝处理(添加量0.5%，50 ℃水浴处理2 h)，处理后将工艺水离心(5 000 r,10 min)去下层沉淀，再接种培养，测定酶活力值，酶活力柱形图见图5。不同方法处理过后，可以看出，白土、活性炭和硫酸铝处理后，酶活力与处理前相比有一定的提高，白土处理的酶活力增幅最大，为40%，活性炭和硫酸铝分别为6%和18.9%，而乙酸锌和亚铁氰化钾处理过后蛋白酶活力反而减弱，可能是由于亚铁离子的加入抑制了微生物的生长和产酶能力，因此选择白土处理为最佳的工艺水处理办法。

图5 不同处理方法对蛋白酶活力的影响

2.5 不同发酵时间蛋白酶活力的变化

将工艺水用白土处理过后，按80%的添加比例配制产酶培养基，在36 ℃，200 r/min产酶条件下进行培养，分别在24、48、72、96、120 h测定蛋白酶活力，制作蛋白酶活力变化曲线，判断枯草芽孢杆菌在工艺水中的最佳产酶时间，蛋白酶活力曲线见图6。

图6 枯草芽孢杆菌不同发酵时间产酶活力曲线图

从图6可以看出，枯草芽孢杆菌在工艺水中前发酵24 h未测出明显酶活力，由于在接种初期微生物处于迟缓期和对数期，代谢产酶量未积累，因此酶活力无法测出。随着培养时间的延长，酶活力逐渐上升，到第96小时达到最高，然后逐渐下降，可以大致判断，枯草芽孢杆菌在营养化后的工艺水中产酶的最佳时间约为培养后的96 h。

2.6 茶皂素对微生物代谢产酶的影响

在枯草芽孢杆菌产酶培养液中添加浓度梯度为：0%，0.25%，0.5%，0.75%的茶皂素，按其最佳培养时间和条件进行培养，96 h后测定蛋白酶活力，不同浓度茶皂素对枯草芽孢杆菌产酶的影响见图7。

图7 不同浓度茶皂素对产酶的影响

不同批次以及不同保存方法和取样部位的工艺水中，茶皂素含量有不同。本试验所用批次的茶籽油工艺水中茶皂素含量约为0.6%，因此选择0%～1.0%的浓度范围，由图7可以看出，随着茶皂素添加比例的增加，枯草芽孢杆菌的产酶活力并未受到明显抑制，浓度达到0.5%之后，随着浓度的增加产酶活力稍有下降，但在添加茶皂素的培养液中，酶活力高于未添加茶皂素的培养液，因此初步判断茶皂素对枯草芽孢杆菌产酶不存在明显的抑制作用。

2.7 重现性

蛋白酶活力测定重现性见表1～表3。

表1 4种微生物蛋白酶活力测定重现性试验结果

表2 不同比例工艺水中酶活力测定重现性试验结果

表3 不同处理方法酶活力重现性试验结果

3 结论

通过对4种微生物蛋白酶活力的测定，选择了产碱性蛋白酶活力较高的枯草芽孢杆菌接种到水酶法提取茶籽油产生的工艺水中，经过产酶条件的优化和废水的预处理，得出最佳的预处理办法为：白土预处理2 h(添加量6%)，按80%的工艺水添加比例在原有产酶培养液的基础上配制工艺水优化产酶培养液，相对有利于枯草芽孢杆菌产蛋白酶，在工艺水中最佳的产酶时间约为培养后96 h，测出枯草芽孢杆菌在优化后的工艺水培养基中最高产酶活力为34.8 u/mL。在枯草芽孢杆菌培养液中添加不同比例的茶皂素，培养后显示茶皂素对其产蛋白酶没有明显的抑制作用。目前，在工艺水中培养微生物所测出的蛋白酶活力偏低，可能是由于工艺水中除了残余油脂和茶皂素以外，还有某种成分不利于微生物的产酶，因此接下来可以对工艺水的成分做进一步的分析，确定抑制产酶的成分，在最大限度保存茶皂素的前提下，优化产蛋白酶活性，达到更好的利用和处理水酶法提取茶籽油工艺水的目的。

[1]Rosenthal A,Pyle D L,Niranjan K.Aqueous and enzymatic processes for edible oil extraction[J]．Enzyme and Microbial Technology,1996,19(6):402-420

[2]Dominguez H，Nuez M J,Lema J M.Enzymatic pretreatment to enhance oil extraction from fruits and oil seeds：a review[J].Food Chemistry,1994,49(3):271-286

[3]刘向宇. 一株碱性蛋白酶产生菌的分离与应用[D].长沙:湖南农业大学, 2011

[4]邱秀宝,袁影,戴宏,等,嗜碱性芽孢杆菌碱蛋白酶的研究Ⅱ:诱变株选育及产酶条件[J].微生物学报，1990,30(2):129-133

[5]裘娟萍.提高碱性蛋白酶生产效益的措施[J].氨基酸和生物资源，1996,18(2):32-35

[6]冯清平，沈剑敏，高燕．紫外诱变原生质体选育碱性蛋白酶高产菌株的研究[J].兰州大学学报：自然科学版,1994,30(4):83-87

[7]姚开波. 微生物混菌发酵法提纯油茶皂素的工艺研究[D]. 长沙:湖南农业大学, 2013

[8]姚刚. 枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的研究[J]. 食品科学, 2009, 30(23):347-351

[9]孙倩. 地衣芽孢杆菌产碱性蛋白酶发酵条件优化[J]. 食品工业科技, 2012, 33(13):174-177

[11]潘进权. 纳豆芽孢杆菌发酵产蛋白酶工艺优化[J]. 中国粮油学报, 2011, 26(9):33-37

[12]熊海燕, 李莹. 不同果汁发酵液中酵母茵生长曲线的测定及pH值的变化[J]. 农产品加工, 2009(4):26-27

[13]GB/T 23527-2009, 蛋白酶制剂[S]

[14]GB/T 601-2002, 化学试剂标准滴定溶液的制备[S].

Microorganism Producing Alkaline Protease Using Waste Water Produced by Extraction of Camellia Oil in Aqueous Enzymatic Method

Su Wu1,2Zheng Xiaofen1,2Xu Ruixuan1,2Jiang Liwen2,3Guo Hua1,2Zhou Jianping1,2

(College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University1, Changsha 410128)(Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology2, Changsha 410128)(Hunan Provincial Research Center of Engineering and Technology for Fermented Food3, Changsha 410128)

Four kinds of protease producing microorganisms have been screened to find the kind with the highest yield of alkaline protease in the paper. The bacillus subtilis has been selected after the screening. It was inoculated to the waste water produced from extraction of Camellia oil through aqueous enzymatic method to produce protease; improved protease production by optimizing the enzyme production conditions. The optimal enzyme production conditions were as follows: the waste water adsorbed by bleaching earth for 2 h, centrifuged at 5 000 r/min for 10 minutes, added to the water in the proportion of 80%, incubation time for 96 h. On the basis of the original enzyme production nutrient solution formula (yeast leaching powder 2%, sugar 1.0%, 0.5% tween-80, 0.02% magnesium sulfate, pH 9.0, inoculums size 4% (V/V)), bacillus subtilis could achieve the highest enzyme activity of 34.8 u/mL on the conditions of the enzyme production.

camellia oil, waste water, microorganism, protease activity

TS225.1

A

1003-0174(2016)03-0059-05

国家863计划(2012AA102107)

2014-08-20

苏悟，女，1990年出生，硕士，粮食油脂植物蛋白工程

蒋立文，男，1968年出生，教授，食品生物技术