固定化α-淀粉酶制备麦胚蛋白工艺条件优化

吴 定 谢慧慧 黄卉卉 路桂红 刘长鹏 付懋林

(南京财经大学食品科学与工程学院1，南京 210046)

固定化α-淀粉酶制备麦胚蛋白工艺条件优化

吴 定1谢慧慧1黄卉卉1路桂红1刘长鹏1付懋林1

(南京财经大学食品科学与工程学院1，南京 210046)

固定化α-淀粉酶 麦胚蛋白质 因子筛选 工艺优化

小麦胚芽中蛋白质含量高达31%～35%，分别是主粮大米、小麦粉的4.9倍和3.2倍[1]。麦胚蛋白质的组成中，清蛋白占30.2%，球蛋白占18.9%，麦醇溶蛋白占14%，麦谷蛋白占0.3%～0.4%，水不溶性蛋白占30.2%[1-5]。

小麦胚芽蛋白(简称麦胚蛋白)是一种完全蛋白质，含有20～23种氨基酸，而胚芽蛋白质中人体健康需要的8种必需氨基酸占总氨基酸的35%，尤其是赖氨酸含量很高，比鸡蛋高2倍，比大米、小麦粉高 6～7倍[1-10]。小麦胚芽蛋白中氨基酸模型与FAO/WHO颁布人体健康氨基酸建议模型相似[3-10]。

研究显示，用游离α-淀粉酶水解麦胚蛋白提取液中淀粉，比非酶法可使蛋白质含量和提取率分别提高15%和12%，蛋白质纯度达94%[11]。麦胚蛋白溶解度与pH值有关，在pH 4.0时溶解度最小，大于pH 6.0的液体中有很好的溶解度[3]。

固定化α-淀粉酶可以反复使用多次，从而降低游离酶只能使用一次的生产成本。同时，固定化α-淀粉酶酶促反应控制比游离酶方便。

目前，用游离α-淀粉酶制备麦胚蛋白工艺已有报道[11]，而用固定化α-淀粉酶制备麦胚蛋白工艺鲜见报道。因此，为了开发小麦麦胚蛋白生产新工艺，进行了固定化α-淀粉酶制备麦胚蛋白工艺条件的试验优化研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料

脱脂小麦胚芽试验样品、固定化α-淀粉酶：南京财经大学发酵工艺实验室[12-13]。

1.2 主要设备

TGL-16G型高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；THZ-22型恒温振荡机：上海世平实验设备有限公司；FD-1B型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 麦胚蛋白质含量测定(GB 5009.5—2010)

1.3.2 麦胚蛋白质得率

蛋白质得率=[(提取蛋白质质量×提取蛋白质含量)/(麦胚粉质量×麦胚粉蛋白质含量)]×100%

1.3.3 麦胚蛋白提取工艺

脱脂小麦胚芽，经过超微粉碎，过筛(100～200 目)后，称取一定量脱脂麦胚粉，按照质量/体积(g/L)比加入一定量盐溶液(1∶4～1∶8)，在一定温度(30～50 ℃)振荡浸泡提取一定时间(40～60 min)，经过离心(16 000 r/min)，收获上层麦胚乳液。麦胚乳液，用酸调pH 5.0～7.0，加入固定化α-淀粉酶，置于一定温度(55～65 ℃)水解一定时间(60～80 min)，取出固定化酶，酶水解液调pH值到4.0，经过离心(16 000 r/min)，取沉淀用pH 7.0纯净水溶解，装入透析袋于4～8 ℃透析，透析液经过冷冻干燥得到麦胚蛋白质。

1.3.4 Plackett-Burman试验设计因子水平

Plackett-Burman(PB)设计，是一种从多因素中选取对试验指标有显著影响因子的方法。在单因素试验的基础上，对小麦胚芽粉碎颗粒目数(以下简称麦胚目数)、小麦胚芽粉质量与浸提液体积比值(以下简称料液比)、浸提温度、浸提时间、麦胚乳pH值、固定化酶水解麦胚乳液温度(以下简称酶水解温度)和固定化酶水解麦胚乳液时间(以下简称酶水解时间)进行Plackett-Burman试验设计，确定了PB设计每个因素的上、下限(表1)。

表1 影响水平试验设计

利用Design expert7.1.3软件，设计了7个影响因子PB试验方案(表3)。按照设计的试验序号和试验水平参数进行试验。

1.3.5 响应曲面优化固定化酶制备麦胚蛋白工艺设计

通过PB设计，筛选出贡献大的3个影响因子进行响应曲面优化水平组合试验(表2)。

表2 响应面分析因子水平表

采用design expert7.1.3软件中Box-Behnken对因子1(料液比)、因子2(麦胚乳pH值)和因子3(酶水解温度)进行三因子三水平试验设计，并依照试验序号进行试验(表5)。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计及分析

表3 Plackett-Burman试验设计方案和试验结果

表4 试验模型中各影响因子方差分析表

注:***表示极显著(P<0.001)；**表示显著(P<0.05)；*表示不显著(P>0.10)。

当P值<0.05，说明该模型项影响显著，试验建立模型中B、E、F项的P值都小于0.05，其中E项(P=0.000 1)影响最大，其次是F项(P=0.000 5)和B项(P=0.0067)。当P值>0.10，说明该模型项影响不显著，而A、C、D、G项的P值都大于0.10，所以这些因子对模型影响贡献均很小。因此，固定化酶制备麦胚蛋白的影响因子依次排序为：麦胚乳的pH值(E)>酶水解温度(F)>料液比(B)。

2.2 固定化酶制备麦胚蛋白显著影响因子的优化

依据 Box-Behnken中心组合设计原理，采用蛋白质得率作为试验响应值，设计响应面分析试验。Box-Behnken 试验设计及其试验结果见表5。

根据表5的试验结果，运用响应面分析程序对蛋白质得率进行回归分析，经过回归拟合得到蛋白质得率(Y)与3个影响因子回归方程：

Y=79.633 3+0.842 5X1+1.132 5X2-1.027 5X3-0.067 5X1X2-7.50E-003X1X3-0.622 5X2X3-0.302 9X12-2.177 9X22-1.892 9X32

表5 Box-Behnken试验设计及试验结果

表6 模型可信度分析统计结果

2.3 麦胚蛋白质得率模型显著性分析

通过 Design-expert 分析软件，对回归方程模型进行方差分析(表7)。 模型具有高度的显著性(F=19.98，P=0.002 1) ; 相对于纯误差来说，失拟(F=0.41)不显著(表7)。因此，该模型可以用来试验预测。

表7 回归方程模型各项的方差分析

注:***表示极显著(P<0.001)；**表示显著(P<0.05)；*表示不显著(P>0.10)。

若P值<0.05，说明影响因子有显著影响；若P值>0.10，表明影响因子无显著影响。3个影响因子对固定化酶制备麦胚蛋白质工艺都有显著影响，其影响力依次排序：麦胚乳pH值(X2)>酶水解温度(X3)>料液比(X1)(表7)。3个因子中两因子交互作用的无显著影响。

对模型方程进行逐步回归，回归方程存在稳定编码值(+0.92、+0.05、-0.28)，稳定点的特征值表明为稳定点的目标点，即固定化酶制备麦胚蛋白优化工艺参数：料液比为1∶7.84、麦胚乳pH值为5.025和酶水解温度为58.6 ℃。在此条件下，麦胚蛋白质得率的预测值为80.34%。考虑到应用控制的方便性，将优化工艺参数修订为料液比为1∶7.8、麦胚乳pH值为5.0和酶水解温度为58.5 ℃。

2.4 响应曲面分析与优化

依据模型回归方程，作响应面曲面图，考察了拟合响应面的形状，其响应面曲线如图1～图3所示，反映了固定化酶制备麦胚蛋白质工艺中3个主要影响因子对麦胚蛋白质得率的影响。

图1显示，在酶解温度60 ℃条件下，麦胚乳pH值和料液比对蛋白质得率的影响。料液比一定水平时，麦胚乳pH值在-1～0水平范围内，随着pH值增加，蛋白质得率快速增加；在0～0.5水平范围内，随着pH值增加，蛋白质得率先缓慢增加，然后缓慢下降；在0.5～1水平范围内，随着pH值增加，蛋白质得率又开始较快下降。麦胚乳pH值一定水平时，料液比在-1～0.5水平范围内，随着料液比增加，蛋白质得率快速增加；在0.5～1的水平范围内，随着料液比增加，蛋白质得率增加缓慢。

图2显示，在麦胚乳pH 5.0条件下，酶水解温度和料液比对蛋白质得率的影响。料液比一定水平时，酶水解温度在-1～0水平范围内，随着酶水解温度增加，蛋白质得率直线增加；酶解温度0水平时蛋白质得率最高；在0～1水平范围内，随着酶水解温度增加，蛋白质得率快速下降。酶水解温度一定水平时，在料液比在-1～0.5水平范围内，随着料液比的增加，蛋白质得率直线增加；在0.5～1水平范围内，随着料液比得增加，蛋白质得率缓慢增加。

图3显示，在料液比1∶6条件下，酶水解温度和麦胚乳pH对蛋白质得率影响。麦胚乳pH一定水平时，酶水解温度在-1～0水平范围内，随酶水解温度增加，蛋白质得率随之增加，在酶解温度0水平时，蛋白质得率达到最大值；在0～1的水平范围内，随着酶解温度增加，蛋白质得率随之下降。酶水解温度一定水平时，麦胚乳pH值在-1～0水平单位内，随pH值得增加，蛋白质得率快速直线增加；在0～0.5水平范围内，随pH值增加，蛋白质得率增加缓慢；在0.5～1水平范围内，随pH增加，蛋白质得率缓慢下降。

2.5 优化工艺验证试验

按照修订的优化工艺参数，共进行8批次样本平行试验，平均蛋白质得率达到80.11%，与预测得率80.34%有很好吻合度。

3 结论

采用PB试验及其影响因素方差分析，固定化酶制备麦胚蛋白的重要影响因子依次排序为：麦胚乳的pH值(E)>酶水解温度(F)>料液比(B)。

采用麦胚乳的pH值、酶水解温度和料液比进行响应面分析试验，得到麦胚蛋白质得率回归方程：

通过方差分析显示，麦胚乳的pH值、酶水解温度和料液比对固定化酶制备麦胚蛋白工艺有显著影响。

通过对模型回归方程逐步回归，得到固定化酶制备麦胚蛋白优化工艺参数：料液比为1∶7.8、麦胚乳pH值为5.0和酶水解温度为58.5 ℃。在此条件下，麦胚蛋白质得率达到80.11%。

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Optimization of Preparation Process on Wheat Germ Protein by Immobilizedα-Amylase

Wu Ding1Xie Huihui1Huang Huihui1Lu Guihong1Liu Changpeng1Fu Maolin1

(School of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics1, Nanjing 210046)

immobilized α-amylase，wheat germ protein，factor screening，process optimization

TS210.9

A

1003-0174(2016)03-0115-05

江苏省教育厅高新技术产业(JHB04-003)

2014-08-04

吴定，男，1962年出生，教授，食品生物工程