不同高山杜鹃品种花粉活力测定及贮藏方法研究

陆琳，彭绿春，宋杰，李树发，解玮佳，李世峰

（云南省农业科学院花卉研究所，国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明650205）

不同高山杜鹃品种花粉活力测定及贮藏方法研究

陆琳，彭绿春，宋杰，李树发，解玮佳，李世峰

（云南省农业科学院花卉研究所，国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明650205）

以大白花杜鹃、XXL、亮叶杜鹃、马缨花杜鹃和黄杯杜鹃为研究对象，采用花粉离体培养，比较不同的贮藏条件下花粉活力随贮藏时间的变化情况。结果表明，不同杜鹃品种花粉培养基琼脂均为0.7%，大白花杜鹃最适萌发培养基为：蔗糖50 g/L，硼酸50 mg/L，氯化钙50 mg/L；马缨花杜鹃最适萌发培养基为：蔗糖100 g/L，硼酸30 mg/L，氯化钙30 mg/L；黄杯杜鹃、XXL和亮叶杜鹃最适萌发培养基均为：蔗糖100 g/L，硼酸0 mg/L，氯化钙30 mg/L；不同品种的杜鹃花新鲜花粉萌发率差异较大，按花粉萌发率从大到小排序为黄杯杜鹃＞亮叶杜鹃＞大白花杜鹃＞XXL＞马缨花杜鹃；黄杯杜鹃花花粉在4个不同温度贮藏条件下花粉萌发率均比XXL和马缨花杜鹃高，说明黄杯杜鹃花花粉的活力较强，在杂交育种中可以优先考虑。

杜鹃花；花粉生活力；贮藏；萌发率

杜鹃花是世界上最重要的观赏花卉之一，在全世界有900多个种，而在我国分布有近600种[1]，主要分布于西南地区的云南、西藏、四川省，这3个省共有400多种杜鹃花，占我国种类的近80%。云南是杜鹃花的世界分布中心之一，有着丰富的种质资源[2-4]。大白花杜鹃（Rhododendron decorum）、亮叶杜鹃（Rhododendron vernicosum）、马缨花杜鹃（Rhododendron delavayi Franch）、黄杯杜鹃（Rhododendron wardii）在云南省境内分布广泛，花大而鲜艳，叶常绿，株形美丽，具有较高的观赏价值，应用较为广泛，不仅适宜种植于街道绿地和公园，也可作盆栽，布置花坛、花境、草地点缀等，是不可多得的园林花卉。XXL（Rhododendron XXL）是进口品种，也是目前市场上比较流行的品种。由于我国现有高山杜鹃的品种基本依赖于进口，致使其产业发展受到了严重制约，通过杂交育种的方法培育杜鹃花新品种意义重大。

杂交育种是培育杜鹃花新品种的重要手段之一，而杂交亲本花粉生活力的高低直接影响着育种的成效，故研究花粉活力检测方法对杜鹃花杂交育种研究很有必要。杜鹃花杂交育种中有应用醋酸洋红、TTC以及MTT染色法测定花粉活力的报道[5-8]，而MTT染色法测定结果与花粉体内萌发率最为接近[9]。Brewbaker-Kwack培养基已被用于测定杜鹃花花粉活力[8]，该培养基适用于大多数的植物花粉培养。我国杜玉虎等[10]、瞿学杰等[11]、李俊英等[12]研究了果梅、杂交榛、大叶杨等植物的花粉离体萌发培养，证明了花粉离体培养萌发法是一种比较简便且较为准确的花粉活力检测方法。张超仪等[13]、李玉萍等[14]对睫毛杜鹃、多鳞杜鹃、薄皮杜鹃、映山红、马银花和比利时杜鹃等杜鹃花的花粉离体萌发培养基配方进行了研究，结果表明，不同杜鹃花种类的花粉离体培养配方并不相同。

本试验以大白花杜鹃、亮叶杜鹃、马缨花杜鹃、XXL和黄杯杜鹃为研究对象，在不同的贮藏条件下比较花粉活力随贮藏时间的变化情况，从而了解花粉的适宜贮藏条件；通过对不同高山杜鹃品种花粉生活力及贮藏温度的研究，以解决高山杜鹃花期不一致，提高杂交组合成功率，为高山杜鹃花杂交育种提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为3年生以上的杜鹃实生苗，平均株高56～60 cm，冠幅30 cm左右，品种为大白花杜鹃、亮叶杜鹃、马缨花杜鹃、XXL和黄杯杜鹃。供试植株皆为露地栽培，生长良好，种植于云南春禾园林科技有限公司基地。采集开花前1～2 d或刚开花的花朵，带回实验室后剪取花药，收集于垫有硫酸纸的培养皿内，室内阴干1～2 d。待花粉自然散出，收集花粉，装于1 mL冻存管中，于干燥器内密封保存。

1.2 方法

1.2.1 最佳花粉萌发培养基筛选参考单因子完全随机试验，确定6个培养基组分配方为：1.蔗糖100 g/L＋H3BO30 mg/L＋CaCl20 mg/L；2.蔗糖100 g/L＋H3BO30 mg/L＋CaCl230 mg/L；3.蔗糖100 g/L＋H3BO330 mg/L＋CaCl20 mg/L；4.蔗糖100 g/L＋H3BO330 mg/L＋CaCl230 mg/L；5.蔗糖50 g/L＋H3BO320 mg/L＋CaCl220 mg/L；6.蔗糖50 g/L＋H3BO350 mg/L＋CaCl250 mg/L。以上培养基中均加入0.7%的琼脂，调节pH值为6.0，筛选适宜高山杜鹃花花粉萌发的最佳组合。

1.2.2 花粉培养在双孔凹型载玻片孔内滴入0.1 mL的培养基，将充分混合后的花粉用毛笔蘸取均匀撒播于培养基表面。将玻片置于铺有2层湿滤纸的培养皿中，在（25±1）℃的培养箱中培养6 h后，统计萌发的花粉粒数和未萌发的花粉粒数。

在40×显微镜下观察统计，因杜鹃花花粉为四合体，所以在统计花粉萌发数时，只要有1个萌发即视为萌发。花粉萌发后，每隔1 h观测一次。最终测定时间以2次测定萌发率基本相同开始，设3次重复，每个处理统计10个视野，每个视野观察不少于50粒花粉，以花粉管长度超过花粉直径为萌发标准。萌发率＝已萌发的花粉粒数/测定的花粉粒总数×100%。

1.2.3 不同贮藏条件及不同贮藏时间下花粉萌发力的测定采用以下4种方法密封保存高山杜鹃花花粉：（1）室温保存（20℃）；（2）4℃保存；（3）-16℃低温保存；（4）-80℃超低温保存。从花粉贮藏开始，每隔一定时间定期检测花粉萌发率。取少量的花粉均匀地撒播于最适培养基上，在25℃培养箱中经最适时间培养后镜检，统计花粉的萌发率。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对杜鹃花花粉萌发的影响

表1 不同培养基对杜鹃不同品种花粉萌发率的影响%

从表1可以看出，新鲜高山杜鹃花花粉在不同培养基上萌发率差异较大。大白花杜鹃最适萌发培养基为6号培养基，高浓度的硼和钙离子能促进该品种的花粉萌发；马缨花杜鹃花粉萌发率最低，在最适萌发培养基4号上只有32.3%的萌发率；黄杯杜鹃、XXL和亮叶杜鹃最适萌发培养基均为2号培养基，在没有硼酸的情况下，这3个品种的花粉萌发率分别达到83.5%，45.6%和74.4%。结果表明，钙离子对高山杜鹃花粉萌发影响更大，适宜的离体培养基配方因杜鹃花品种不同而不同。

同时，不同品种的杜鹃花新鲜花粉萌发率差异较大（表1），按花粉萌发率从大到小排序为黄杯杜鹃＞亮叶杜鹃＞大白花杜鹃＞XXL＞马缨花杜鹃。结果表明，高山杜鹃在添加不同浓度的硼离子和钙离子后，能有效促进花粉萌发，对于萌发率高的品种，在以后的育种中应加以重视。

2.2 不同贮藏方法对大白花杜鹃花粉活力的影响

花粉的长期贮藏对种质保存和杂交育种十分重要。在花粉贮藏中，贮藏温度对花粉生活力影响最大。低温、干燥有利于花粉活力的保存，这是由于花粉贮藏期间可溶性糖类和有机酸消耗减少。

对不同贮藏方式下不同贮藏时间的大白花杜鹃花粉萌发进行检测，结果表明，在室温下（20℃）10 d后的花粉萌发率仅为1.5%，在相同的贮藏时间下，随着贮藏温度的降低花粉萌发率呈升高趋势，但随着贮藏时间的延长，花粉萌发率逐步下降。贮藏的前30 d，-80℃贮藏的大白花杜鹃花粉萌发率高于-16℃贮藏，但贮藏至40 d时，-16℃贮藏的大白花杜鹃花粉萌发率（17.9%）高于-80℃贮藏（16.4%）（表2）。表明花粉短期（30 d内）贮藏用-80℃较好，长期（30 d以上）以-16℃贮藏较好。

表2 大白花杜鹃花粉在不同贮藏温度下的萌发率%

2.3 不同贮藏条件对杜鹃花不同品种花粉萌发的影响

对不同贮藏方式及时间下杜鹃花不同品种花粉萌发进行了检测。从表3可以看出，室温（20℃）贮藏至10 d时，黄杯杜鹃花粉萌发率达到53.9%，而XXL和亮叶杜鹃的花粉萌发率分别仅为6.9%和15.1%，贮藏至20 d左右各个品种之间的花粉萌发率差别大，黄杯杜鹃能达到40%以上，而其余2个品种的花粉萌发率均不到6%，说明高山杜鹃花花粉活力在常温下贮藏时间较短。不同的高山杜鹃花花粉低温贮藏的时间差别也较大，以黄杯杜鹃花花粉的贮藏时间最长，在-80℃时，贮藏120 d花粉萌发率还能达到45%，而XXL虽然在贮藏120 d后还能测得花粉萌发率，但仅为10.5%，亮叶杜鹃在贮藏90 d后花粉萌发率不到10%，在相同的贮藏时间下，随着贮藏温度的降低花粉萌发率呈升高趋势，但随着贮藏时间的延长，花粉萌发率逐步下降。不同贮藏条件下杜鹃花不同品种花粉萌发率差异较大，黄杯杜鹃花花粉在4个不同贮藏条件下花粉萌发率均比另外2个品种高，说明黄杯杜鹃花花粉的活力较强，在杂交育种中可以优先考虑。

表3 不同品种及不同贮藏方式对高山杜鹃花粉萌发率的影响

3 讨论

不同高山杜鹃花的花粉萌发培养基并不相同，有效的培养基配方能促进花粉的萌发，添加不同浓度的硼离子和钙离子能提高高山杜鹃花粉的萌发率。硼离子与糖形成络合物，易于在组织中运输和参与果胶物质的合成，以利于花粉管的建造，从而促进花粉萌发与花粉管的生长，但其浓度要求因植物不同而异[15]。

不同种类花粉能够长期贮藏的时间也有所不同，为了探讨杜鹃花粉的贮藏条件和解决育种过程中花期不遇引起的授粉困难，本试验研究了不同贮藏条件及贮藏时间下花粉萌发率的变化，并对4种不同贮藏温度下花粉生活力进行了单因素对比试验。结果表明，低温冷冻是高山杜鹃花粉的最佳贮藏条件。低温贮藏的花粉之所以能保持较高的活力，可能是由于低温不但能降低可溶性糖类和有机酸类物质的消耗，还能降低呼吸强度和酶活性[16]，延长花粉的寿命。花粉的生活力除了受贮藏温度影响外，还受到贮藏环境的湿度、花粉自身含水量等因素的影响。研究表明，贮藏温度越低，花粉贮藏寿命就越长。另外，过高或过低的贮藏环境湿度也会降低花粉的萌发率，大多数植物花粉的最适贮藏环境湿度在40%～60%[17]。对百合品种花粉贮藏特性的研究表明，冷冻贮藏有利于保持百合花粉生活力[17]，而山梅花在冷冻贮藏条件下的花粉萌发数最低[18]。本研究表明，冷冻贮藏有利于保持大白花杜鹃花粉生活力，由此可见，不同物种间花粉贮藏条件存在显著差异。因此，研究杜鹃花粉贮藏时的含水量与贮藏方式，找出适合于各种花粉的贮藏方法对杂交育种具有重大意义。

另外，在本研究中还发现，不同杜鹃花种类的新鲜花粉萌发率差异较大，在供试的5个杜鹃品种中，马缨花杜鹃的花粉萌发率最低，这可能与它的生物学特性有一定的关系，还有待于进一步深入研究。

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Study on Viability and Storage Capacity of Pollen among Different Rhododendron lapponicum Cultivars

LU Lin，PENG Lyu-chun，SONG Jie，LI Shu-fa，XIE Wei-jia，LI Shi-feng
（National Engineering Research Center for Ornamental Horticulture，Institute of Flower，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming650205，China）

To investigate the pollen viability of Rhododendron lapponicum cultivars,the pollen germination rate of Rhododendron decorum,Rhododendron XXL,Rhododendron vernicosum,Rhododendron decorum Franch and Rhododendron wardii were determined by culture in vitro under different storage conditions.The results showed that the optimal germination medium of pollen for Rhododendron decorum was sucrose 50 g/L＋H3BO350 mg/L＋CaCl250 mg/L＋0.7%agar;sucrose 100 g/L＋H3BO330 mg/L＋CaCl230 mg/L＋0.7%agar for Rhododendron decorum Franch；sucrose 100 g/L＋H3BO30 mg/L＋CaCl230 mg/L＋0.7%agar for Rhododendron wardii,Rhododendron XXL and Rhododendron vernicosum.There were significant differences in germination rate of pollen among difference Rhododendron cultivars,the germination rate of pollen was in order as:Rhododendron wardii＞Rhododendron vernicosum＞Rhododendron decorum＞Rhododendron XXL＞Rhododendron decorum Franch.The germination rate of pollen of Rhododendron wardii under 4 different storage temperature conditions were higher than that of Rhododendron XXL and Rhododendron decorum Franch,which indicated the pollen of Rhododendron wardii performance higher vitality,which can be applied in hybrid breeding.

Rhododendron;pollen vitality;storage;germination rate

S685.21

A

1002-2481（2016）02-0175-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.11

2015-10-28

云南省科技计划项目（2015BB013）

陆琳（1976-），女，云南昆明人，副研究员，主要从事云南特色园林花卉的种质资源创新研究工作。李世峰为通信作者。