谷子秸秆黄色素提取的响应面分析

张春凤，郝林

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

谷子秸秆黄色素提取的响应面分析

张春凤，郝林

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

以谷子秸秆为原料，研究微波-乙醇助提秸秆中黄色素的工艺条件。通过单因素试验考察乙醇体积分数（V/V）、微波功率、微波辐射时间、料液比及提取次数对谷子秸秆中黄色素提取的影响，并由因子筛选试验选出显著影响因素；在此基础上，采用Box-Behnken响应面试验设计确定最佳工艺。结果表明，最佳提取工艺条件为：72%乙醇（V/V）为提取剂，料液比为1∶20（g/mL），320 W微波处理30 s，提取3次，得到色素提取液平均吸光度为0.634，与软件预测值0.641基本一致（相对误差1.09%）。

谷子秸秆；微波-乙醇助提；黄色素；响应面

近年来，食品中合成色素的安全性已引起越来越多的关注。据文献报道[1-4]，合成色素在不同程度上存在慢性毒副作用和致癌性，其应用受到限制和禁止；而天然色素主要来自于动、植物组织，安全性和营养价值高，具有一定的生物活性和抑菌、抗菌作用，且其色调与食品天然色调接近。这些优势决定了天然色素必将取代合成色素，成为消费的主流。黄色素是一类重要的天然色素，占色素总需求量的60%，具有广阔的应用前景[5]。目前，常用的黄色素种类不多，且价格昂贵。因此，寻求和挖掘天然色素新资源，对保障人民身体健康和促进食品工业的发展具有重大意义。

谷子是我国种植面积较大的杂粮作物之一[6]。山西省素有“小杂粮王国”之称，每年都会生产得到大量的谷子秸秆。随着人民生活水平的提高，秸秆已不再适合作为家庭能源使用；而且秸秆回收利用成本高，运输不便，效益不明显。因此，就地焚烧成为农户的首选，这会造成严重的大气污染。有研究表明，谷物中的色素大部分属于类胡萝卜素、花色素，其种皮或秸秆、胚芽中含有大量的天然色素[7]。目前，国内外对玉米和小米黄色素研究报道较多，而对谷子秸秆中黄色素的研究尚未见报道。微波法提取玉米黄色素具有时间短、耗能少、效率高等特点，被广泛应用于天然色素的生产中[8]。微波法提取秸秆黄色素，特别是响应面法优化其提取工艺的研究未见报道。提取谷物中的色素类物质，不仅为天然色素开拓了新资源，又为农副产物的深细加工和增值、谷子秸秆的处理方法开辟了一条新途径[9-11]。

本试验以张杂谷10号的秸秆为原料，以一定浓度的乙醇溶液为提取剂，微波提取黄色素。在单因素试验和因子筛选试验的基础上，采用Box-Behnken响应面试验设计进行工艺条件的优化，以期获得最佳提取工艺，为谷子秸秆的工业化生产奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

谷子秸秆（张杂谷10号）来自山西农业大学农作站；无水乙醇为国产分析纯。

UV WinLab V6紫外可见分光光度计（珀金埃尔默仪器有限公司）；JDG-0.2真空冻干试验机（兰州科近真空冻干技术有限公司）；R2010-Ⅱ型旋转蒸发器（郑州长城科工贸有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；722 G可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；HCP-100型华晨高速多功能粉碎机（浙江省永康市金穗机械制造厂）；ML-2080 EG型微波炉（青岛胶南海尔微波制品有限公司）；TDL-4低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试验方法

本试验于2014年12月至2015年1月在山西农业大学食品学院实施完成。

1.2.1 色素提取工艺原料→清洗→40℃热风干燥→粉碎→过筛（0.25 mm）→微波辅助一定浓度乙醇提取→抽滤→离心（4 000 r/min，10 min）→减压浓缩（45℃，0.08 MPa）→初步纯化→冷冻干燥（板温40℃，真空度40～50 Pa）→黄色素粗提物（橘红色粉末）。

1.2.2 最大吸收波长的确定将色素提取液稀释至一定浓度（以吸光度大小计），用紫外可见分光光度计在380～800 nm进行光谱扫描，确定该色素在可见光范围内的最大吸收波长。

1.2.3 单因素试验分别称取一定量秸秆粉末，加入相应提取剂，于反应装置中反应一段时间，抽滤、离心后取上清液，在最大吸收波长处测其吸光度。每个处理重复3次，取平均值。以乙醇体积分数（V/V）40%，60%，80%，100%，微波功率160，320，480，640，800 W，微波辐射时间10，20，30，40，50，60 s，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g/mL）及提取次数1，2，3次分别进行单因素试验，确定最佳的提取工艺参数。

1.2.4 Plackett-Burman因子筛选试验在单因素试验基础上，对乙醇体积分数（X1）、微波功率（X2）、微波辐射时间（X3）、料液比（X4）和提取次数（X5）进行PB试验，以色素提取液吸光度为响应值。每个因素取2水平（以-1，1编码），自变量因素水平列于表1。

表1 Plackett-Burman试验因素水平

1.2.5 响应面法优化提取工艺在单因素和因子筛选试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理[12]，以乙醇体积分数、微波辐射时间和提取次数3个显著影响因子为自变量，吸光度为评价指标，设计3因素3水平的响应面试验，自变量因素水平如表2所示。其他因素条件为：微波辐射功率320 W，料液比1∶20（g/mL）。

表2 响应面试验因素水平

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

以95%乙醇溶液为提取剂，380～800 nm波长内对谷子秸秆黄色素提取液进行光谱扫描。该色素在444 nm处有最大吸收峰，即最大吸收波长为444 nm（图1）。因最大吸收波长处灵敏度大，吸光度随物质浓度变化的幅度最大，也可避免其他物质的干扰，所以，选择最大吸收波长为444 nm。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对色素提取的影响从图2可以看出，随乙醇体积分数增大，色素提取液吸光度逐渐增大；当乙醇体积分数达到80%时，色素提取液吸光度最大；超过80%后，色素提取液的吸光度逐渐减小。这可能是由于乙醇溶液浓度太低时，水分含量多，不能有效地将色素溶出；若乙醇浓度太高，会溶出大量醇溶蛋白，蛋白质与色素形成复合物，离心时会带走部分色素，使其含量下降。因此，最佳乙醇体积分数以80%为宜。

2.2.2 微波辐射功率对色素提取的影响由图3可知，随微波功率增大，色素提取液吸光度逐渐增大，在320～640 W之间达到峰值。这可能是由于随微波功率逐渐增强，机械振动效应加强，当功率大于320 W时，微波对秸秆的组织结构产生了较强的破坏作用，体系中有微小的淀粉粒析出，这些淀粉粒会吸附部分色素分子，被吸附的色素分子在随后的离心过程中会随淀粉等大分子颗粒发生沉降分离，从而导致提取液中色素含量下降[13]；同时又由于微波功率太大，易导致热效应，使提取物体系因温度急剧上升而爆沸，破坏了色素结构，且容易发生危险[14-15]。因此，最佳微波辐射功率以320W为宜。

2.2.3 微波辐射时间对色素提取的影响由图4可知，当微波功率一定时，随微波辐射时间的延长，色素提取液的吸光度逐渐增大；当微波辐射时间达到20 s时，色素提取液吸光度最大，超过20 s后，色素提取液吸光度又逐渐下降。这可能是由于同等质量的物料在相同功率条件下，微波辐射时间越长，提取物体系吸收的微波能就越多，物料温度也会越高，可加快体系扩散速度[16]；当微波辐射时间过长，提取物长期处于较高温度下，色素的部分结构可能遭到破坏。因此，最佳微波辐射时间以20 s为宜。

2.2.4 料液比对色素提取的影响由图5可知，随料液比减少，色素提取液吸光度逐渐增大；当料液比为1∶25（g/mL）时，色素提取液吸光度最大，而小于1∶25（g/mL）时，吸光度逐渐下降。这可能是由于当料液比较高时，提取剂与物料的浓度差较小，色素提取不完全；随着料液比的减小，溶剂体系的扩散速度增大，有利于色素溶出；但当料液比低于1∶25（g/mL）后，吸光度基本不变，可能是色素已完全浸出。当料液比为1∶20，1∶25（g/mL）时，吸光度变化不大，考虑到过大提取剂用量会造成溶剂浪费，后续浓缩回收困难，生产成本高。因此，最佳料液比以1∶20（g/mL）为宜。

2.2.5 提取次数的确定由图6可知，随提取次数增加，色素提取液的吸光度逐渐增大，但由于提取次数过多，导致溶剂浪费，浸提时间延长，且后续工作繁多。因此，提取次数以2次为宜。

2.3 Plackett-Burman试验因子筛选结果分析

Plackett-Burman试验设计与结果如表3所示，经Minitab 16.0软件对表3进行方差分析，结果如表4所示。

从表4可以看出，该模型显著（P＜0.05），说明此模型可以进行因子的筛选。乙醇体积分数、微波辐射时间和提取次数对谷子秸秆色素提取液的吸光度影响显著，而微波功率和料液比对吸光度影响不显著。因此，选择乙醇体积分数、微波辐射时间和提取次数进行响应面试验。

表3 Plackett-Burman试验设计与结果

表4 Plackett-Burman试验方差分析

2.4 响应面结果分析

2.4.1 回归模型的建立及方差分析按照表5进行组合试验，采用Design Expert 8.0.5统计分析软件进行方差分析，拟合后得到乙醇体积分数、提取次数和微波辐射时间的二次多项式回归方程。

对回归模型（1）进行方差分析，结果列于表6。从表6可以看出，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟相对于纯误差不显著（P＞0.05），说明试验误差小。回归模型的决定系数R2为0.992 6，说明响应值的变化有99.26%来自于自变量。该回归模型的自变量与响应值之间存在良好的线性关系，对试验的拟合度较好，可以客观地描述各自变量与响应值之间的真实关系。

从表6可以看出，一次项A和C对秸秆黄色素吸光度的影响极显著，B对秸秆黄色素的影响不显著；交互相AC对秸秆黄色素的影响极显著，而AB和BC对其的影响不显著；二次项A2对其影响极显著，B2和C2对其影响不显著。说明各因素对谷子秸秆黄色素提取工艺的影响不是简单的线性关系[17]。

表5 响应面设计方案与试验结果

表6 回归模型的方差分析

2.4.2 各因素交互项的响应面分析[18]从图7可以看出，乙醇体积分数和提取次数的交互作用对该色素的提取影响极显著，该曲面较陡，响应值变化越大，且轴向等高线密集；乙醇体积分数对色素提取的影响不及提取次数显著，曲面缓和，轴向等高线相对稀疏。

由图8可知，微波辐射时间和乙醇体积分数的交互作用对该色素的提取影响不显著；微波辐射时间对秸秆黄色素吸光度的影响不显著。图7，8结果与回归方程的方差分析结果相吻合，说明响应面试验设计可以较好地反映自变量对响应值的影响。

2.4.3 提取工艺的优化及验证试验通过回归方程的预测，谷子秸秆黄色素的最佳提取工艺为：乙醇体积分数72%，料液比1∶20（g/mL），微波辐射功率320 W，微波辐射时间30 s，提取3次。按最佳提取条件进行验证试验，重复3次，得色素提取液平均吸光度为0.634，与软件预测值0.641基本一致（相对误差1.09%）。这也说明响应面法适合对色素的提取进行回归分析和参数优化。

3 讨论与结论

体积分数高的乙醇提取会造成大量醇溶蛋白溶出，且试验成本较高，而体积分数低的乙醇因水分含量高，物料吸收微波能少，色素溶出也较少。本试验优化得到的最佳乙醇体积分数为72%，既减少了醇溶蛋白等杂质，降低了成本，又保证了提取效果。本试验设计了多个单因素试验，并采用Plackett-Burman因子筛选试验确定出主要影响因子，避免了因为单因素选择不佳而造成响应面模型的不显著，进而不能真实地描述自变量与响应值之间的关系。

本研究在单因素和因子筛选试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计原理，建立各影响因素的二次回归模型。利用统计学方法对该模型进行回归分析，得出该回归模型可以客观地描述各自变量与响应值之间的真实关系。一次项A和C对秸秆黄色素吸光度的影响极显著，B影响不显著；交互相AC影响极显著，AB和BC影响不显著；二次项A2影响极显著，B2和C2影响不显著。说明各因素对谷子秸秆黄色素提取工艺的影响不是简单线性关系。通过响应面分析可知，微波-乙醇助提法可实现高效、快速提取。响应面分析结果表明，秸秆黄色素最佳提取工艺为：乙醇体积分数为72%（V/V），料液比1∶20（g/mL），微波功率320 W，微波处理时间30 s，提取3次。在此条件下进行验证试验，得到黄色素提取液的吸光度为0.634，这与预测值0.641基本一致。

［1］王海棠，田子俊，阳勇，等.小米黄色素的研究Ⅱ—提取工艺及稳定性[J].中国粮油学报，2005，20（5）：40-45.

［2］Munawar N，Jamil H M T H.The islamic perspective approach on plant pigments as natural food colourants[J].Procedia Social and Behavioral Sciences，2014，121：193-203.

［3］李宗哲，李德远，苏丹，等.天然色素加工新进展及发展对策研究[J].中国食物与营养，2015，21（2）：39-42.

［4］Assous MT M，Abdel H MM，Medany G M.Evaluation of red pigment extracted from purple carrots and its utilization as antioxidant and natural food colorants[J].Annals of Agricultural Sciences，2014，59（1）：1-7.

［5］呼延晓颖，单磊，达超超，等.黄色素提取工艺的研究进展[J].饮料工业，2011，14（2）：9-1.

［6］杨延兵，管延安，秦岭，等.不同地区谷子小米黄色素含量与外观品质研究[J].中国粮油学报，2012，27（1）：14.

［7］张丙华，张晖，朱科学.谷物色素研究进展[J].粮食与食品工业，2009，16（4）：18-21.

［8］Farhat A，Fabiano-Tixier A，Maataoui M E，et al.Microwave steam diffusion fou extraction of essential oil from orange peel：Kinetic data，extract's global yield and mechanism[J].Food Chemistry，2011，125（1）：255-261.

［9］Tang J，Mao R，Tung MA，et al.Gelling temperature，gel clarity and texture of gellan gels containing fructose or sucrose[J].Carbohydrate Polymers，2001，44：197-209.

［10］Pallaroni L，Von Holst C，Eskiisson C，et al.Microwave-assisted extraction of zearalenone from wheat and corn[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2002，374（1）：161-166.

［11］Grigonis D，Venskutonis P R，Sivik B，et al.Comparation of different extraction techniques for isolation of antioxidants from sweet grass（Hierochloë odorata）[J].The Journal of Supercritical Fluids，2005，33（3）：223-233.

［12］Dong C H，Xie X Q，Wang X L，et al.Application Box-behnken design in optimization for polysaccharides extraction from cultured mycelium of Cordyceps sinensis[J].Food and Bioproducts Processing，2008，53：1-6.

［13］赵猛，朱洪梅.小米黄色素超声波辅助提取工艺的响应面优化[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2009，37（10）：182-183.

［14］Dragan Znidarcic，Dean Ban，Helena Sirelj.Carotenoid and chlorophyll composition of commonly consumed leafy vegetables in Mediterranean countries[J].Food Chemistry，2011，129：1164-1168.

［15］李晓玲，陈相艳，王世清，等.超微粉碎辅助超声-微波法提取玉米黄色素[J].中国食品学报，2014，14（8）：99-106.

［16］姚壮和.微波辅助提取芒果皮黄色素的研究[J].现代食品科技，2013，29（8）：1973-1975.

［17］Alisa Perry，Helen Rasmussen，Elizabeth J Johnson.Xanthophyll（lutein，zeaxanthin）content in fruits，vegetables and corn and egg products[J].Journal of Food Compostion and Analysis，2009，22：9-15.

［18］赵广河，谢慧媛，陈振林.微波辅助提取桃金娘色素的工艺研究[J].中国食品添加剂，2015（1）：71-76.

Analysis of Response Surface about Yellow Pigment Extracted From Millet Straw

ZHANG Chun-feng，HAO Lin
（College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The paper took the millet straw as raw material to study the extraction technology of yellow pigment by microwave-ethanol solution.Through the single factor experiments,it investigated the influence of some factors on the extraction of yellow pigment from millet straw,such as ethanol content（V/V）,microwave power,microwave processing time,solid-liquid ratio and extraction times.Then it chose significantly influencing factors by factor screening test.Based on that,the paper used the Box-Behnken response surface method to design the experiment to determine the best process.The result showed that the optimum extracted conditions was as follows:72%ethanol（V/V）was extracting agent,solid-liquid ratio was 1∶20（g/mL）,320 W microwave processed 30 s,extracting 3 times.The average absorbance of pigment extracting solution was 0.634,which was similar with the predicted value（the relative error was 1.09%）.

millet straw;microwave-ethanol extraction;yellow pigment;response surface

S515

A

1002-2481（2016）02-0242-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.29

2015-10-13

张春凤（1990-），女，山东济宁人，在读硕士，研究方向：现代杂粮生产。郝林为通信作者。