离子束介导的小麦变异材料农艺性状及生理生化指标分析

高 飞， 谷运红， 肖 靖， 张 明

(1．遵义医学院物理教研室， 贵州遵义 563003；2．郑州大学离子束生物工程省重点实验室， 河南郑州 450052)

离子束介导的小麦变异材料农艺性状及生理生化指标分析

高 飞1， 谷运红2， 肖 靖2， 张 明1

(1．遵义医学院物理教研室， 贵州遵义 563003；2．郑州大学离子束生物工程省重点实验室， 河南郑州 450052)

[目的]探讨离子束诱变和转基因技术在农作物诱变育种中的应用效果。[方法]利用离子束介导外源基因组DNA转化选育出一些特殊的小麦变异材料，研究在常温水培、4 ℃冷胁迫、聚乙二醇(PEG)逆境条件下变异材料2叶期过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、脯氨酸(Pro)含量，以及成熟期株高、千粒重、叶绿素含量、蛋白质含量等指标的变化情况。[结果]经过离子束介导转化处理后的小麦变异系材料在各种逆境条件下生理生化指标都有变化，并且一些材料相比对照表现出良好的优越性；小麦变异系材料各农艺性状相比对照均有明显差异。[结论]离子束介导转基因技术能创造丰富的小麦变异类型。

离子束；小麦变异材料；抗逆性；农艺性状

小麦是我国重要的粮食作物之一[1]。用各种高新技术改良种子或创建新的种质资源，可优化生物过程、发展农业经济、提高转化效率[2]。离子束育种技术已被应用于小麦[3]、水稻[4]、大豆[5]、棉花[6]、烟草[7]等作物及微生物[8]。离子束育种技术在新生物品种改良以及诱变方面有显著成效[9]。

目前，采用离子束技术进行外源遗传物质的转化主要包括2个方面，即离子束介导目的基因的遗传转化和离子束介导总DNA 的遗传转化[4]。当植物受到不同环境因素胁迫时，植物中的脯氨酸(Pro)含量、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性会发生很大的变化，引起植物中脯氨酸含量、CAT活性、POD活性不同程度的积累，且积累指数与植物的抗逆性有关。笔者以利用离子束介导外源全基因组DNA转化选育出的一些特殊的小麦变异材料作为研究对象，探讨了离子束介导转化对小麦变异材料农艺性状及生理生化指标的影响，以期为离子束介导转化在小麦育种中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 试验材料是2004年通过离子束对小麦干种子以3×1017N+/cm2剂量注入，以200 μg/mL供体基因组DNA溶液浸泡所得，转化供体为燕麦和六倍体小黑麦全基因组DNA，转化受体为豫麦49(编号为8101)得到的变异材料。经过多年的选育，得到一批特殊的变异系材料，材料编号及转化组合的来源见表1。

表1 变异材料信息

1.2 抗逆性胁迫模拟试验 对变异材料各挑选100粒完整、饱满种子，70%乙醇消毒10 min，用蒸馏水冲洗3次，分成3份，每份30粒左右。用蒸馏水将种子浸泡在培养皿中24 h，用滤纸吸干种子表面水分，然后分为以下3组：常温水培处理作为对照；4 ℃冷胁迫处理；聚乙二醇(PEG)溶液胁迫处理。取36个150 mm培养皿，铺上双层滤纸，高温灭菌后储存备用。

1.2.1 水培方法。取出1组萌发的种子，将萌发种子的胚朝上，均匀摆放在培养皿中的滤纸上，放入20 ℃光照培养箱中进行水培，每天加入适量蒸馏水，以保持滤纸湿润。

1.2.2 胁迫培养方法。

1.2.2.1 4 ℃冷胁迫培养。取出1组萌发的种子，将萌发种子的胚朝上，均匀摆放在培养皿中的滤纸上，放入4 ℃光照培养箱中进行水培，每天加入适量蒸馏水，以保持滤纸湿润。

1.2.2.2 PEG胁迫培养。取出1组萌发的种子将萌发种子的胚朝上，均匀摆放在培养皿中的滤纸上，向培养皿中加入适量PEG溶液，放入20 ℃光照培养箱中进行水培，每天加入适量蒸馏水，以保持滤纸湿润。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 脯氨酸含量的测定。待种子在培养箱生长到2叶期时，称取一定量叶片，用TU-1901双光束紫外可见分光光度计进行脯氨酸含量测定。

将100 μg/mL标准脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μg/mL的标准溶液，用分光光度计在520 nm波长处测定吸光度，以OD520为横坐标，脯氨酸含量为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线：y=17.414x-0.775 4，式中y为脯氨酸含量(μg/g)，x为紫外吸光度。

1.3.2 POD、CAT活性的测定。待种子在培养箱中生长到2叶期时，称取1 g幼苗，加入5 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，收集上清液，4 ℃保存，测量提取液总体积。POD、CAT活性测定方法及药品配制均根据李玲的《植物生理学》中的实验方法[10]，略做修改。应用TU-1901型双光束紫外可见分光光度计测定吸光值。每个样品3次重复，用Origin 8.0软件作图。

1.3.3 小麦叶片SPAD值的测量。在2012年的4月10日、4月25日(抽穗期)、5月6日、5月12日、5月24日对材料顶1叶中部进行测量，每个材料测3株，观察不同时期叶绿素变化情况。

1.3.4 小麦种子蛋白质含量、湿面筋、吸水率的测定。在接近成熟期时，每个材料随机选取5株，测量株高，成熟收获后测量每个材料的千粒重，用NIRsystems 5000型近红外光谱仪测量变异材料籽粒的蛋白质含量、湿面筋和吸水率。在对籽粒进行近红外光谱扫描前，将所有样品置于光谱仪室平衡24 h，使样品环境条件与仪器的环境条件一致。采集光谱时，将小麦样品装入样品槽，使用机器内置参比，扫描区间在1 100～2 498 nm，扫描步长为2 nm，采集反射强度(R)，仪器将对每个样品自动进行全区间扫描30次，取平均光谱。每个单株样品设3次重复，扫描完光谱后将采集的光谱反射强度输入计算机并转化为log(1/R)存储。按照遵义医学院物理教研室建立的预测方程对样品的蛋白质含量进行预测。每个材料的20个单株都将获得2个预测的蛋白质含量值，其平均值为该品种材料的蛋白质含量。

1.4 数据处理 利用SPSS统计分析软件对全生育期农艺性状考察结果进行统计分析及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同逆境条件下小麦变异材料脯氨酸含量分析 由图1可知，在常温水培条件下，材料8509、8512的脯氨酸含量均高于8101，材料8160、8505、8507、8508、8510、8511、8513、8340、5647的脯氨酸含量均低于8101；8512是所有材料中脯氨酸含量最高的，比8101脯氨酸含量高出15.00%，8505是所有材料中脯氨酸含量最低的，比8101脯氨酸含量低52.00%。

图1 不同逆境条件下小麦变异材料脯氨酸含量Fig.1 Pro content of wheat variation materials under different adversity conditions

在PEG胁迫条件下，材料8160、8505、8507、8508、8513、8340、5627的脯氨酸含量均高于8101，材料8509、8510、8511、8512的脯氨酸含量均低于8101；8505是所有材料中脯氨酸含量最高的，比8101脯氨酸含量高出69.00%，8512是所有材料中脯氨酸含量最低的，比8101脯氨酸含量低33.00%。

在4 ℃冷胁迫条件下，材料8160、8505、8508、8509、8510、8511、8512、8513、8340、5647的脯氨酸含量均高于8101，8507脯氨酸含量低于8101；8509是所有材料中脯氨酸含量最高的，比8101脯氨酸含量高出206.00%，而8508是所有材料脯氨酸增长比例最高的，比8101脯氨酸含量高出237.00%，8507是所有材料中脯氨酸含量最低的，比8101脯氨酸含量低13.00%。

因此，在不同逆境条件下，变异材料8160、8505、8508、8510、8513、8340、5647的脯氨酸含量在PEG和4 ℃冷胁迫条件下均高于自身对照，8509、8512在常温水培条件下均高于8101，8160、8505、8508、8513、8340、5647在PEG和4 ℃冷胁迫条件下均高于8101，说明在常温水培条件下与8101对比，8509和8512脯氨酸含量较高，8160、8505、8508、8513、8340、5647在逆境条件下脯氨酸含量不仅比对照高而且比8101高，表明8160、8505、8508、8513、8340、5647可能具有较好的抗逆性。

2.2 不同逆境条件下小麦变异材料CAT活性分析 由图2可知，在常温水培条件下，材料8160、8508、8510、8511、8512的CAT活性均高于8101，材料8505、8507、8509、8513、8340、5647的CAT活性均低于8101；8160是所有材料中CAT活性最高的，比8101的CAT活性高出75.00%，5647是所有材料中CAT活性最低的，比8101的CAT值低46.00%。

在PEG胁迫条件下，材料8160、8505、8509、8512的CAT活性均高于8101，材料8507、8508、8510、8511、8513、8340、5647的CAT活性均低于8101；8505是所有材料中CAT活性最高的，比8101的CAT活性高出71.00%，8510是所有材料中CAT活性最低的，比8101的CAT活性低79.00%。

图2 不同逆境条件下小麦变异材料CAT活性Fig.2 CAT activity of wheat variation materials under different adversity conditions

在4 ℃冷胁迫条件下，材料8509、8510、8512的CAT活性均高于8101，材料8160、8505、8507、8508、8511、8513、8340、5647的CAT活性均低于8101；8510是所有材料中CAT活性最高的，比8101的CAT活性高出103.00%，8160是所有材料中CAT活性最低的，比8101的CAT活性低12.00%。

因此，在不同逆境条件下，变异材料8505、8509的CAT活性在PEG和4 ℃冷胁迫下均高于自身对照，在常温水培条件下8160、8508、8510、8511、8512的CAT活性均高于8101，8509、8512在PEG和4 ℃冷胁迫条件下均高于8101，说明在常温水培条件下与8101对比，8160、8508、8510、8511、8512的CAT活性较高，8509在逆境条件下的CAT活性不仅比对照高而且比8101高，表明8509可能具有较好的抗逆性。

2.3 不同逆境条件下小麦变异材料POD活性分析 由图3可知，在常温水培条件下，材料8510的POD活性高于8101，材料8512的POD活性接近8101，其他材料的POD活性均低于8101；8510是所有材料中POD活性最高的，比8101的POD活性高出1.74%，8508是所有材料中POD活性最低的，比8101的POD活性低92.17%。

图3 不同逆境条件下小麦变异材料POD活性Fig.3 POD activity of wheat variation materials under different adversity conditions

在PEG胁迫条件下，材料8160、8508、8509、8510、8511、5947的POD活性均高于8101，材料8505、8507、8512、8513、8340的POD活性均低于8101；8160是所有材料中POD活性最高的，比8101的POD活性高出359.00%，8512是所有材料中POD活性最低的，比8101的POD活性低24.11%。

在4 ℃冷胁迫条件下，材料8160、8505、8509、8510、8511、8512、8513、8340、5647的POD活性均高于8101，材料8507、8508的POD活性均低于8101；5647是所有材料中POD活性最高的，比8101的POD活性高出613.00%，8508是所有材料中POD活性最低的，比8101的POD活性低37.50%。

因此，材料8160、8505、8509、8511、8340、5647的POD活性在PEG胁迫条件下均高于自身对照。在低温条件下各材料POD活性都下降，在常温水培条件下8510、8512的POD活性均高于8101，8610、8505、8509、8510、8511、5647在PEG和4 ℃冷胁迫条件下均高于8101，说明在常温水培条件下与8101对比，8510、8512的POD活性较高，8610、8505、8509、8511、5647在逆境条件下的POD活性不仅比对照高而且比8101有所提高，表明8610、8505、8509、8511、5647可能具有较好的抗逆性。

2.4 小麦变异系农艺性状分析 由表2可知，材料8340的株高与对照8101相比显著降低，而8505、8507、8508、8509、8511、8512的株高极显著增加；材料8160、8505、8340的千粒重与对照相比显著增加，8511的千粒重极显著增加；材料8508的蛋白质含量与对照相比极显著降低，而8160、8512、8513的蛋白质含量显著增加，8340的蛋白质含量极显著增加；材料8160、8512的湿面筋与对照相比显著增加，8340的湿面筋极显著增加；材料8160、8505、8507、8508、8509、8512、8513的吸水率与对照相比极显著增加。

2.5 小麦变异系叶绿素农艺性状分析 SPAD是土壤与作物分析仪器开发 (Soil and Plant Analyzer Development)的英文缩写，日本基于叶绿素对不同类型光吸收利用差异研制的叶绿素计(SPAD仪)可在田间条件下简单、无损地预测各类作物叶片单位面积的叶绿素含量。植株叶片SPAD值与叶绿素含量呈显著正相关。

由表3可知，4月25日，材料8505、8510、8512的SPAD值与对照8101相比显著降低，而8511、8340的SPAD值极显著降低；5月12日，材料8512、8340的SPAD值与对照相比极显著降低，而8160的SPAD值极显著增加；5月24日，材料8505、8506、8511的SPAD值与对照相比显著降低，而8508、8509、8512、8340的SPAD值极显著降低。

3 结论与讨论

经过离子束介导转化处理后的小麦变异系材料不论是农艺性状还是抗逆性都有显著变化，所以要从不同的角度分析出每个变异材料的特性，加深对变异材料变异类型的了解，以指导育种实践。

首先要分析的是离子束处理后得到的小麦变异系在逆境条件下的生理生化指标，在常温水培条件下与8101对比，材料8509和8512的脯氨酸含量较高，材料 8160、8508、8510、8511、8512的CAT活性较高，材料 8510、8512的POD活性较高，可知变异材料8512在水培条件下脯氨酸含量、CAT、POD活性相比对照均有所增加；在PEG模拟干旱和4 ℃冷胁迫条件下与8101对比，材料 8160、8505、8508、8513、8340、5647的脯氨酸含量较高并且比对照也高，材料8509、8512 的CAT活性较高，材料 8610、8505、8509、8511、5647的POD活性较高并且仅比对照高，可知变异材料8106、8505、5647 在逆境条件下脯氨酸含量、POD活性相比对照均有所增加，而材料8509、8512 在逆境条件下CAT活性相比对照均有所增加。综上，经过离子束介导转化处理后的小麦变异系材料无论在常温还是逆境条件下生理生化指标都有所变化，并且一些材料相比对照表现出良好的优越性。

表2 小麦变异系农艺性状

注：*和**分别表示P<0.05和P<0.01。

Note:*indicatedP<0.05;**indicatedP<0.01。

表3 小麦变异系在不同时期叶绿素含量(SPAD)

注：*和**分别表示P<0.05和P<0.01。

Note:*indicatedP<0.05;**indicatedP<0.01。

其次要分析的是离子束处理后得到的小麦变异系农艺性状，对材料的株高、千粒重、蛋白质含量、湿面筋、吸水率进行差异显著性分析，得出小麦变异系材料各农艺性状相比对照均有明显差异。

由此可见，离子束介导转基因技术能创造丰富的小麦变异类型，该研究为以后变异材料的改进和利用提供了理论依据。参考文献

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Agronomic Traits and Physiological and Biochemical Index of Ion Beam Mediated Wheat Genome Variation

GAO Fei1, GU Yun-hong2, XIAO Jing2et al

(1.Physics Teaching Research Group, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou 563003; 2.Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering, Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450052)

[Objective] The aim was to explore the great application value of ion beam mutagenesis and transgenic technology in crop mutation breeding. [Method] We carried out ion beam mediated whole genome DNA into some special variation of wheat materials,and then in conditions of normal temperature water, 4 ℃ cold stress and PEG stress, studied change of peroxidase (POD) activity,catalase (CAT) activity and proline (Pro) content of two-leaf variation materials, as well as the change of plant height, grain, chlorophyll content and protein content of variation materials at mature period.[Result] After dealing with the ion beam mediated transformation of wheat materials in all sorts of adversity under the condition of physiological and biochemical indexes were changed, and some material compared with contrast highlighted advantages.The agronomic traits of wheat materials compared with controls all had obvious difference.[Conclusion] The ion beam mediated transgenic technology can create rich wheat variation types.

Ion beam;The variation of wheat materials;Stress resistance;Agronomic trait

国家自然科学基金项目(11375154)；郑州大学校级教改项目(2014XJGLX101)。

高飞(1984- )，男，山西霍州人，讲师，硕士，从事生物物理学研究。

2016-10-19

S 512.1

A

0517-6611(2016)35-0001-04