山荆子叶总黄酮提取工艺研究

黄占波， 宋冬梅， 尚海巍， 刘 彬

(1.辽宁科技学院生物医药与化学工程学院，辽宁本溪 117004；2.辽宁泰阳医药科技开发有限公司，辽宁本溪 117004)

山荆子叶总黄酮提取工艺研究

黄占波1， 宋冬梅2， 尚海巍1， 刘 彬1

(1.辽宁科技学院生物医药与化学工程学院，辽宁本溪 117004；2.辽宁泰阳医药科技开发有限公司，辽宁本溪 117004)

[目的]优化超声波提取山荆子叶总黄酮的最佳工艺。[方法]以山荆子叶为材料提取总黄酮，采用单因素和正交试验，以提取物中总黄酮提取率为考察指标优化提取工艺。[结果]山荆子叶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度50%，料液比(g∶mL)1∶25，提取时间30 min，该条件下总黄酮的提取率为14.1%。[结论]利用超声辅助提取山荆子叶总黄酮获得了较好的效果，可为山荆子资源的综合利用提供参考。

山荆子叶；总黄酮；超声提取；正交试验

山荆子[Malusbaccata(Linn.)Borkh.]又名山丁子、林荆子等，为蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)多年生落叶乔木，广泛分布于我国东北、华北及西南地区[1]。山荆子果实具有止吐、止泻、防止各种感染的功能，对肺结核有一定疗效，国外还将其用以治疗肠道疾癌[2]，其幼叶富含多种人体必需的氨基酸，民间有将其制茶饮用的传统[3-4]。研究表明，山荆子中含有丰富的多酚类、黄酮类化合物[5-7]，叶总黄酮能明显降低糖尿病小鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平，改善糖尿病小鼠空腹血糖值和口服葡萄糖耐受量水平[6]；叶提取物可调节脂肪的消化和代谢，具有减肥效果[8]；叶和果实乙醇提取物均具有较强的抗氧化活性和还原力[9-10]，对CCl4诱导的小鼠肝损伤具有较好的保护作用[11]，对癌细胞增殖有抑制活性[10]。目前，山荆子叶总黄酮的提取工艺研究尚少见系统报道，仅见山荆子果实总黄酮和抗氧化物质的提取工艺研究[12-13]，而山荆子的果实、嫩叶均有较高的经济价值，开发潜力巨大。因此，笔者对山荆子幼叶总黄酮的超声提取工艺进行了研究，旨在为有效利用山荆子资源提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料 原料与主要试剂：山荆子嫩叶，2016年5月份采于辽宁科技学院后山，阴干；芦丁对照品，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠，均为分析纯；D-101大孔吸附树脂，天津市光复精细化工研究所。

主要仪器设备：KQ-300VBD型三频数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE52-99型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；7230G可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；CPA225D微量电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；水循环真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制。参考山楂叶[14]总黄酮含量测定方法，制得0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液。精密量取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分别置于25.00 mL比色管中，加水至6.00 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.00 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.00 mL，混匀，放置6 min，加1 mol/L氢氧化钠溶液10.00 mL，加水定容至25.00 mL，混匀，放置15 min，以空白溶液为对照，在500 nm波长处测定吸光度(A)。回归方程为A=10.524C+0.005 8，R2=0.999 3。

1.2.2 样品溶液的制备及总黄酮含量测定。将山荆子叶干燥，粉碎，过20目筛，称取1.0 g，置100.00 mL具塞锥形瓶中，加入一定量溶剂超声提取，提取液过滤，滤液减压浓缩，转移至100.00 mL容量瓶中，加水定容。精密量取1.00 mL提取液于25.00 mL比色管中，按“1.2.1”方法操作，测定提取液的吸光度，由回归方程计算总黄酮的浓度，山荆子叶中总黄酮的提取率按下式计算:

总黄酮提取率(%)=(C×V1×V2)/ (V3×m) ×100式中,C为样品中总黄酮质量浓度(mg/mL)；V1为提取液的体积(100.00 mL)；V2为提取液稀释后的体积(25.00 mL)；V3为量取提取液的体积(1.00 mL)；m为山荆子叶的取样量(mg)。

1.2.3 单因素试验。

1.2.3.1 乙醇浓度对提取率的影响。固定料液比(g∶mL)1∶20，超声功率300 W，提取时间20 min，提取1次，考察提取溶剂水及20%、40%、60%、80%、100%乙醇对山荆子叶总黄酮提取率的影响。

1.2.3.2 料液比对总黄酮提取的影响。固定提取溶剂为60%乙醇，超声功率300 W，提取时间20 min，提取1次，考察料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶60对山荆子叶总黄酮提取率的影响。

1.2.3.3 超声功率对总黄酮提取的影响。固定提取溶剂为60%乙醇、料液比1∶20，提取时间20 min，提取1次，考察超声功率120、180、240、300 W对山荆子叶总黄酮提取率的影响。

1.2.3.4 提取时间对总黄酮提取的影响。固定提取溶剂为60%乙醇，超声功率300 W，料液比1∶20，提取1次，考察提取时间10、20、40、60、80 min对山荆子叶总黄酮提取率的影响。

1.2.3.5 提取次数对总黄酮提取的影响。固定提取溶剂为60%乙醇，超声功率300 W，提取时间20 min，料液比1∶20，考察提取次数对山荆子叶总黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交试验。根据单因素试验结果，固定超声功率300 W，提取1次，选取乙醇浓度、料液比及提取时间为考察因素，按L9(34)正交试验优化山荆子叶总黄酮提取工艺，正交试验因素水平设计见表1。

表1 山荆子叶总黄酮提取工艺优化L9(34)正交试验因素水平

Table 1 L9(34)orthogonal test for technique optimization of extracting total flavonoids from the leaves ofMalusbaccata

水平Levels因素Factors乙醇浓度(A)Ethanolconc⁃entration∥%料液比(B)Solid⁃liquidratio提取时间(C)Extractiontime∥min空白(D)Blank1401∶152012501∶203023601∶25403

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对山荆子叶总黄酮提取率的影响 由图1可知，山荆子叶总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加呈现出先升高后减小的趋势，而在40%～80%浓度时提取率变化趋势平缓。综合考虑，选择60%乙醇作为提取溶剂。

图1 乙醇浓度对山荆子叶总黄酮提取率的影响Fig.1 Effects of ethanol concentration on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

2.2 料液比对山荆子叶总黄酮提取率的影响 由图2可知，山荆子叶总黄酮的提取率随着料液比中溶剂用量的增大而增加，当料液比小于1∶20后，总黄酮的提取率变化趋势平缓。综合来看，料液比为1∶20可以达到提取条件要求，因此，该试验中选择料液比1∶20。

图2 料液比对山荆子叶总黄酮提取率的影响Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

2.3 超声功率对山荆子叶总黄酮提取率的影响 由图3可知，山荆子叶总黄酮提取率随超声功率的增加呈先降低后增加趋势，当超声功率为300 W时提取率达到最高，但由于试验设备的局限性，未能试验更高超声功率对提取率的影响。因此，该试验选择300 W作为超声提取功率。

图3 超声功率对山荆子叶总黄酮提取率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

图4 提取时间对山荆子叶总黄酮提取率的影响Fig.4 Effects of extraction time on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

2.4 提取时间对山荆子叶总黄酮提取率的影响 由图4可知，总黄酮提取率随时间的延长呈先上升随后又下降趋势，提取时间10～20 min时上升趋势明显，20～60 min时上升趋势平缓，60 min后呈下降趋势。综合考虑，选择超声提取时间为20 min。

2.5 提取次数对山荆子叶总黄酮提取率的影响 由图5可知，随着提取次数的增加，总黄酮提取率增加，提取2和3次的总黄酮提取率相差不明显，说明提取2次能够满足提取需要，故选择提取次数为2次。

图5 提取次数对山荆子叶总黄酮提取率的影响Fig.5 Effects of extraction times on extraction of total flavonoids from the leaves of Malus baccata

2.6 山荆子叶总黄酮提取工艺正交试验 由表2可知，各因素对山荆子叶总黄酮提取效果的影响顺序依次为料液比、乙醇浓度、提取时间；最优工艺条件为B3A2C2，即山荆子叶总黄酮的最佳提取工艺为料液比1∶25、乙醇浓度50%、提取时间30 min，在此条件下，山荆子叶总黄酮的提取率最高。

表2 山荆子叶总黄酮提取正交试验结果

Table 2 The results of orthogonal test for extracting total flavonoids from the leaves ofMalusbaccata

试验号TestNo．因素FactorsABCD吸光度Absorb⁃ance(A)提取率Extractionrate∥%111110．52010．975212220．55811．878313330．56812．115421230．58012．400522310．58712．567623120．63113．612731320．48410．120832130．52611．117933210．59512．757k111．65611．16511．90112．100k212．86011．85412．34511．870k311．33112．82811．60111．878R1．5291．6630．7440．230

2.7 最佳提取工艺的验证 按照试验确定的最工艺佳条

件，称取山荆子叶5.00 g，做3次平行试验，结果山荆子叶总黄酮的平均提取率为14.1%，相对标准偏差为0.50%。表明通过单因素考察和正交试验确定的提取条件为超声法提取山荆子叶总黄酮的最佳工艺。

3 结论与讨论

山荆子果实作为传统可食用资源具有较高的营养和药用价值，得到了人们的广泛关注，山荆子幼叶虽然也具有丰富的资源和较高的价值，却多是作为废弃物，较少有人研究，造成资源的极大浪费。该研究对山荆子叶总黄酮的超声提取工艺进行了优化，最佳提取工艺为乙醇浓度50%、料液比1∶25、提取时间30 min、超声功率300 W，此条件下总黄酮提取率为14.1%。同时，初步考察了D-101大孔吸附树脂对山荆子叶总黄酮的吸附纯化效果，以60%乙醇作为洗脱剂，最后获得总黄酮纯度达48%、得率为19.4%的山荆子叶总黄酮提取物。

山荆子叶总黄酮提取物可以应用于食品及医药领域，作为天然的黄酮类化合物资源开发潜力较大，既可为黄酮类化合物的获得提供新的资源，也可为山荆子的综合开发利用提供依据。参考文献

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Study on Extraction Technology of Total Flavonoids from the Leaves ofMalusbaccata

HUANG Zhan-bo1, SONG Dong-mei2, SHANG Hai-wei1et al

(1. School of Biological Medicine and Chemical Engineering, Liaoning Institute of Science and Technology, Benxi, Liaoning 117004; 2. Liaoning Taiyang Pharmaceutical Technology Development Co. Ltd., Benxi, Liaoning 117004)

[Objective] The optimum technology of ultrasonic extracting total flavonoids from the leaves ofMalusbaccatawas studied. [Method] With leaves ofMalusbaccataas materials to extract total flavonoids, using single factor and orthogonal test, the extraction rate of total flavonoids in the extract was used as an index, the extraction process was optimized. [Result] The optimum extraction process of total flavonoids was 50% ethanol, solid-liquid ratio (g∶mL)1∶25, extraction time 30 min, the extraction rate of total flavonoids reached 14.1%. [Conclusion] The effect of ultrasonic assisted extraction of flavonoids from the leaves ofMalusbaccatais better, which can provide reference for the comprehensive utilization of the resources ofMalusbaccata.

Leaves ofMalusbaccata; Total flavonoids; Ultrasonic extraction; Orthogonal test

辽宁省科学事业公益研究基金项目(2016003003)；辽宁科技学院博士科研基金项目(1406B05)。

黄占波(1976- )，男，黑龙江绥化人，讲师，博士，从事药物化学教学与研究。

2016-10-28

S 789.4

A

0517-6611(2016)35-0116-03