黄瓜藤提取物抑菌作用研究

王 丽，段黎娟，徐海瑛

(黄河科技学院，河南郑州 450006)

黄瓜藤提取物抑菌作用研究

王 丽，段黎娟，徐海瑛

(黄河科技学院，河南郑州 450006)

[目的]利用不同工艺提取黄瓜藤，研究其提取物抑菌作用。[方法]首先采用水煎煮法和醇提取法对黄瓜藤进行提取，滤纸片法、最低抑菌浓度(MIC)法测定提取液对大肠杆菌、福氏痢疾杆菌的抑菌作用，并用十字交叉法计算抑菌圈的直径。[结果]黄瓜藤水提取液对大肠杆菌和福氏痢疾杆菌的抑菌直径均大于10 mm，黄瓜藤水提取液对大肠杆菌和福氏痢疾杆菌的MIC均为 59.56 mg/mL。甲醇提取液对大肠杆菌和福氏痢疾杆菌的MIC分别为8.69、17.39 mg/mL。[结论]黄瓜藤水提取液和甲醇提取液对大肠杆菌和福氏痢疾杆菌均有抑菌作用，氯仿提取液对大肠杆菌和福氏痢疾杆菌均无抑菌作用。

黄瓜藤；提取物；抑菌作用；大肠杆菌；福氏痢疾杆菌

黄瓜藤(CucumissativiCaulis)是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属植物黄瓜的干燥藤茎，最早始载于《滇南本草》。据文献记载，黄瓜藤有利水、解毒，治痢疾、淋病、黄水疮的功效。在民间，黄瓜藤在猪病上应用较多，特别是治疗猪泄痢效果较好。我国黄瓜藤资源丰富，且目前兽药中的抗菌药来自西药的较多，出现的耐药案例也多[1]。鉴于此，笔者利用不同工艺提取黄瓜藤，研究其不同提取物对大肠杆菌、福氏痢疾杆菌的抑菌作用，为开发新的抗菌类兽药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。大肠埃希菌(Escherichiacoli，ATCC35218)又称大肠杆菌，福氏痢疾杆菌(F′s dysentery bacillus，ATCC29213)，购自武汉大学中国典型生物培养保藏中心。

1.1.2 培养基。水解酪蛋白(Mueller-Hinton，M-H)，北京奥特星生物技术责任有限公司，20090925。M-H肉汤培养基的配制：称取0.30%牛肉膏、1.75%水解酪蛋白、0.15%可溶性淀粉、0.50%氯化钠，放入适量蒸馏水中，调配，加热溶解，调pH 7.2～7.4，分装于试管或生理盐水瓶内，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

1.1.3 药材。黄瓜藤采于郑州市，经黄河科技学院药学教研室王丽副教授鉴定为葫芦科植物黄瓜(CucumissativusL.)的干燥藤茎。备用。

1.1.4 试剂。0.9%氯化钠注射液，山东齐都有限公司，批号1102224102；无菌蒸馏水(自制)；甲醇和氯仿，均为分析纯，天津化学一厂。0.5麦氏比浊管，实验室配制(取0.5 mL 0.048 mol/L BaCl2和99.5 mL 0.18 mol/L H2SO4置于试管内，相当于细菌浓度大致为1.5×108CFU/mL，密封置暗处保存备用)。

1.1.5 仪器。HK-10B 500 g摇摆式粉碎机(广州旭朗机械设备有限公司)；WB-2002水浴锅、R-1002N旋转蒸发仪、SHB-ⅢA循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；超净工作台(上海锦昱科学仪器有限公司，SW-CJ-LFD型)；隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂，PYX-DHS-35X40)；LS-30高压蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，YXA-LS-30SⅡ)。

1.2 样液的提取与制备

1.2.1 药材样液的提取。

1.2.1.1 水煎煮法提取液。将干燥的黄瓜藤粉碎成末，可过40目筛，纤维长度不超过1 cm。取黄瓜藤粗粉20 g置于1 000 mL圆底烧瓶中，加300 mL蒸馏水，加热30 min，放冷抽滤(提取抽滤3次，合并提取液)。浓缩，制成水提取液，浓度为238.24 mg/mL，高压蒸汽灭菌后存于4 ℃冰箱备用。

1.2.1.2 醇提取法提取样液。将黄瓜藤粗粉20 g装于1 000 mL圆底烧瓶中，加入300 mL甲醇，在水浴中加热60 ℃回流提取1 h。放冷抽滤，得到提取液。缩液后置于烧杯中，加入适量的氯仿，用玻璃棒搅拌，静置分层，用梨形漏斗分离，分装入三角烧瓶中，上液溶于甲醇即为甲醇提取液，下层液为氯仿液，浓度为69.56 mg/mL，高压蒸汽灭菌后存于4 ℃冰箱备用。

1.2.2 药材样液稀释液的制备。

1.2.2.1 水提取液稀释液的制备。取6支灭菌试管依次作标记，2～6号管中各加800 μL生理盐水，1号加1 600 μL 样液，从1号取800 μL加入2号管混匀后，取800 μL 加入3号管混匀，依次如上操作至6号管。1～6号管的稀释度分别为原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。

1.2.2.2 甲醇液稀释液的制备。取6支灭菌试管依次作标记，2～6号管中各加入800 μL灭菌生理盐水，1号加入1 600 μL样液，从1号取800 μL加入2号管混匀后，取800 μL加入3号管混匀，依次如上操作至6号管。1～6号管的稀释度分别为原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。

1.2.3 菌液的制备。

1.2.3.1 菌株接种。把供试菌在琼脂培养基的斜面或平板上传代2～3次，使其生长稳定，状态良好。在超净工作台中，用灼烧灭菌过的接种环取状态良好的菌落或菌苔一环，接种于3～5 mL的MH肉汤培养液中，进行扩大培养，置于37 ℃培养箱中培养6～8 h，以待生长至轻微或中等浑浊，分别可制备得到大肠杆菌悬液和福氏痢疾杆菌悬液，取出作为试验菌种[2]。

1.2.3.2 菌液稀释。将增菌后的菌液，用生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准，此时细菌浓度约为1.5×108CFU/mL。再用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用，含菌量约为106CFU/mL 。需要注意稀释液应在15 min内接种完即加入到肉汤中。放置备用。

1.3 测定方法。

1.3.1 牛津杯法测定黄瓜藤提取物的抑菌活性。将稀释好的菌液取出100 μL用棉签均匀涂布在灭菌的平板培养基上，每种细菌设3个重复。将灭菌的平板自然干燥后，取灭菌的3个牛津杯等间距放置在平板培养基上，各加入同种药液100 μL，另外取同一菌种的平板加入相对应的溶剂作为阴性对照[3]。根据原药液的不同分为水提取液、甲醇提取液液、氯仿提取液3组。将3组12个平板置于37 ℃培养箱中培养18～20 h后，取出用签字笔做记号后，使用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值作为结果进行对比研究[4-5]。

根据以上方法测定水稀释液和甲醇稀释液抑菌直径。

参照《微生物检验技术》判定结果[6]：抑菌圈直径≥20 mm为高敏，抑菌圈直径10～19 mm为中敏，抑菌圈直径<10 mm为钝敏。

1.3.2 稀释法药敏试验测定最低抑菌浓度。取已培养的菌液加无菌肉汤稀释至含细菌105CFU/mL。每种细菌做2组，其中一组为水提取液，另一组为甲醇提取液，共编为4组。每组取13 mm×100 mm灭菌试管8支，编号，于每管中加入无菌肉汤培养基2 mL。取1号管加入灭菌药液2 mL，混匀后取出2 mL加入2号管，依次类推，直到6号管取出2 mL弃掉。7号管不加药液做对照，以观察肉汤培养基是否适合细菌生长。8号管加入药液2 mL，混匀后取2 mL弃去，不加细菌做对照，观察受试药液是否受污染。将稀释好的菌液分别取100 μL加入上述1～7号试管中，以无菌生长的药物最高稀释管中的药液浓度为该药液的最低抑菌浓度(MIC)。

1.3.3 结果预判。肉眼观察各试管中的混浊情况，若澄清则判定为无细菌生长，若混浊判定为有细菌生长。首先检查试管中的细菌生长情况，阴性对照孔内应澄清无细菌生长，阳性对照孔内应混浊有细菌生长。参照阳性对照孔和阴性对照孔来观察试验孔。药物最低浓度孔无细菌生长者，即为测定药物对待测菌的单测MIC。

2 结果与分析

2.1 牛津杯法测得的黄瓜藤提取物抑菌效果 由表1可见，黄瓜藤提取物中，水提取液和甲醇提取液对2种细菌均有抑菌作用。水提取液证明黄瓜藤提取物具有抑菌作用，且有效成分能溶于甲醇中。而氯仿提取液则无抑菌活性，氯仿液与氯仿提取液抑菌圈大小相差不大，因此判断黄瓜藤氯仿提取液中成分几乎没有抑菌作用。

表1 黄瓜藤原液提取物对供试菌的抑菌作用

Table 1 The bacteriostatic effect of cucumber stem extract on tested bacteria

黄瓜藤提取物Extractsofcucumberstem大肠杆菌E．coil抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone∥mm敏感度Sensitivity福氏痢疾杆菌F′sdysenterybacillus抑菌圈直径Diameterofinhibitionzone∥mm敏感度Sensitivity水提取液Waterextract10±0．22中敏8±0．03钝敏甲醇提取液Methanolextract10±0．29中敏9±0．36钝敏氯仿提取液Chloroformextract7±0．52钝敏7±0．05钝敏无菌生理盐水SPSS——甲醇Methanol7±0．07钝敏7±0．03钝敏氯仿Chloroform7±0．36钝敏7±0．27钝敏

注：“—”表示没有抑菌圈。

Note：“—” stands for no inhibition zone.

2.2 水提取液、甲醇提取液的最低抑菌浓度 从表2可看出，黄瓜藤水提取液对大肠杆菌及福氏痢疾杆菌的MIC均为 59.56 mg/mL，甲醇提取液对大肠杆菌、福氏痢疾杆菌的MIC分别为8.69、17.39 mg/mL。可见，甲醇提取液对2种细菌的MIC较水提取液小，表明甲醇提取液对大肠杆菌和福氏痢疾杆菌的抑菌活性优于水提取液，抑菌活性较强。水提取液对大肠杆菌和福氏痢疾杆菌的MIC相同，而甲醇提取液对大肠杆菌的MIC小于福氏痢疾杆菌的MIC，表示黄瓜藤提取物有效成分对大肠菌杆的抑菌效果优于福氏痢疾杆菌。

表2 黄瓜藤水提取液和甲醇提取液的最低抑菌浓度

Table 2 The MIC of cucumber stem water extract and methanol extract

稀释度Dilution水提取液Waterextract大肠杆菌E．coil福氏痢疾杆菌F’sdysenterybacillus甲醇提取液Methanolextract大肠杆菌E．coil福氏痢疾杆菌F’sdysenterybacillus1∶1----1∶2-MIC-MIC--MIC1∶4++-MIC+1∶8++++1∶16++++1∶32++++阳性对照Pos⁃itivecontrol++++阴性对照Neg⁃ativecontrol----

注：“-”表示无细菌生长；“+”表示有细菌生长

Note：“-” stands for no bacteria；“+” stands for bacteria growth.

3 结论与讨论

以测量抑菌圈的直径来衡量黄瓜藤不同提取物的抑菌活性，结果证实黄瓜藤水提取液和甲醇提取液有明显的抑菌作用，氯仿提取液则无抑菌作用。同时也说明黄瓜藤的主要抑菌活性成分集中在甲醇提取液即氯仿上层液中。通过该试验为进一步深入研究黄瓜藤的抑菌活性成分及其抑菌机理奠定了基础，为开发廉价且资源丰富的黄瓜藤抗菌制剂以及兽药中的中药抗菌制剂提供科学依据。

[1] 张玉果，高林，于云东.家禽疫病发展规律与中兽药防治中的优势[J].兽药市场指南，2016(1)：39-40.

[2] 郑锦庆，王小宁，岳杰，等.飞机草总黄酮体外抑菌活性与体内抗大肠埃希菌感染效果[J].广东海洋大学学报，2015，35(6)：53-57.

[3] 李仲兴，王秀华，赵建宏，等.应用M-H琼脂进行连翘体外抗菌实验的效果观察[J].中国中药杂志，2000，25(12)：742-745.

[4] 陶虚谷.南蛇藤根皮提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用研究[D].长沙：湖南农业大学，2012.

[5] 闻庆，庞玉新，胡璇，等.艾纳香残渣不同提取部位体外抑菌活性研究[J].广东药学院学报，2015，31(6)：713-716.

[6] 郭积燕.微生物检验技术[M].北京：人民卫生出版社，2008.

Study on the Antibacterial Activity of the Extracts from Cucumber Stem

WANG Li, DUAN Li-juan, XU Hai-ying

(Huanghe S&T College, Zhengzhou, Henan 450006)

[Objective] The aim was to study the antibacterial activity of extracts from cucumber stem by different techniques. [Method] Water decoction and ethanol extraction method were used to extract cucumber stem, filter paper method and MIC was adopted to determine the antibacterial activity toE.coliand F′s dysentery bacillus, the diameter of inhibition zone was calculated by the cross method. [Result]The bacteriostaic diameter of cucumber stem water extract toE.coiland F′s dysentery bacillus was greater than 10 mm, the MIC was 59.56 mg/mL. The MIC of methanol extract toE.coiland F′s dysentery bacillus was 8.69, 17.39 mg/mL, respectively. [Conclusion] The water extracts and methanol parts of cucumber stem had inhibitory effect onE.coliand F′s dysentery bacillus, no antibacterial effect was observed in the chloroform extract ofE.coliand F′s dysentery bacillus.

Cucumber stem; Extracts; Antibacterial activity;Escherichiacoli; F′s dysentery bacillus

王丽(1979- )，女，河南邓州人，副教授，硕士，从事中药质量标准研究。

2016-11-09

S 642.2

A

0517-6611(2016)35-0151-03