熟地黄多糖含量测定方法研究

吴诗云，钟益宁，张 焱，柳 欢，杨丽声，梁礼群

(广西中医药大学，广西南宁 530299)

熟地黄多糖含量测定方法研究

吴诗云，钟益宁*，张 焱，柳 欢，杨丽声，梁礼群

(广西中医药大学，广西南宁 530299)

[目的]建立熟地黄中多糖含量的测定方法。[方法]利用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)分别测定熟地黄中的多糖含量，对检测结果进行比较。[结果]苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法的平均回收率分别为100.5%、99.8%、100.6%，RSD分别为1.6%、1.6%、1.5%，测得的多糖质量分数分别为14.80、14.66、17.46 mg/g。[结论]苯酚硫酸法的结果更可靠，且操作相对简单易行，可考虑作为熟地黄多糖含量测定的首选方法。

熟地黄；多糖；含量测定；苯酚硫酸法；蒽酮硫酸法；3，5-二硝基水杨酸法

熟地黄为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的新鲜或干燥块根经酒炖或蒸法加工炮制而成的[1]。熟地黄多糖是熟地黄的有效成分之一，具有增强机体造血、提高免疫力以及抗氧化等作用[2-6]。当前研究对多糖的测定方法主要是以葡萄糖为对照品的比色法，其中包括苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)。苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法是利用多糖在浓硫酸的作用下生成糠醛或羟甲基糠醛，然后与显色剂反应在特定的波长处有最大吸收。而3，5-二硝基水杨酸法是3，5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性的条件下与还原糖反应生成棕红色的氨基化合物，然后分别通过测定总糖和单糖的质量分数来计算多糖的含量。目前针对熟地黄多糖含量测定方法的选择并没有系统的定论，如何选择经济、简单的方法准确测定熟地黄中多糖的含量成为当前的热点问题。笔者采用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、3，5-二硝基水杨酸法对熟地黄中多糖进行含量测定，通过对比3种方法，选定适合测定熟地黄中多糖含量的比色方法，为后续研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。熟地黄购于老百姓大药房。

1.1.2 试剂。葡萄糖、乙醇、苯酚、蒽酮、酒石酸钾钠、浓硫酸均为分析纯，3，5-二硝基水杨酸为化学纯，国药集团化学试剂有限公司；水为娃哈哈纯净水。

1.1.3 仪器。8453紫外可见分光光度计(美国安捷伦)；电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制。

1.2.1.1 蒽酮硫酸试剂的配制。取0.1 g蒽酮，加入100 mL 80%硫酸溶解，即得蒽酮硫酸试液。

1.2.1.2 DNS试剂的配制。甲液：6.9 g结晶苯酚溶解于15.2 mL 100 g/L的NaOH溶液中，并用蒸馏水稀释至69 mL，再加入6.9 g亚硫酸钠；乙液：称取255.0 g酒石酸钾钠，加到300 mL 100 g/L的NaOH溶液中，再加入10 g/L的DNS溶液880 mL。再将甲乙溶液混合得黄色试剂，储存于棕色瓶中，置室温下7 d后备用[7]。

1.2.1.3 葡萄糖对照品溶液的配制。精密称量葡萄糖对照品0.025 2 g，置于250 mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度。

1.2.1.4 供试品溶液的制备。称取约5 g熟地黄置于圆底烧瓶中，加入100 mL水，水浴回流1 h，重复2次。过滤，合并滤液，滤液减压浓缩至100 mL，加入无水乙醇至含醇量80%，静置24 h，抽滤所得滤渣用无水乙醇洗涤多次后干燥，得到粗多糖；所得粗多糖用蒸馏水完全溶解后定容至250 mL。DNS法单糖样品是精密量取上述样品5.0 mL置于50 mL磨口三角烧瓶中，加入浓盐酸20 mL，摇匀后加塞于100 ℃水浴加热30 min，冷却至室温；加入酚酞指示液，用氢氧化钠溶液调至微红色，转移至50 mL容量瓶中定容。

1.2.2 最大吸收波长的选择。取葡萄糖对照品和熟地黄多糖样品分别用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法和DNS法显色后，用紫外可见分光光度计于200～800 nm进行全波长扫描。

1.2.3 标准曲线的绘制。

1.2.3.1 苯酚硫酸法。精密吸取葡萄糖对照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL，置具塞刻度试管中，分别加水至2.0 mL，精密加入1.4 mL 5%苯酚溶液，摇匀，迅速加入7.0 mL浓硫酸，补水至10 mL，摇匀后放置10 min。以相应试剂为空白，在最大吸收波长处测定相应的吸光度值。以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3.2 蒽酮硫酸法。精密吸取葡萄糖对照品溶液0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0 mL，置具塞刻度试管中，分别加水至2.0 mL，精密加入6.0 mL蒽酮硫酸试液。摇匀后于100 ℃水浴加热15 min，取出后迅速冷却至室温。以相应试剂为空白，在最大吸收波长处测定相应的吸光度值。以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3.3 DNS法。精密吸取葡萄糖对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置具塞刻度试管中，分别加水至6.0 mL，精密加入2.0 mL DNS试液。摇匀后于100 ℃水浴加热5 min，取出后迅速冷却至室温。以相应试剂为空白，在最大吸收波长处测定相应的吸光度值。以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.2.4 精密度试验。精密吸取葡萄糖对照品0.6 mL和供试品溶液0.2 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.1”方法操作；精密吸取葡萄糖对照品1.0 mL和供试品溶液0.5 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.2”方法操作；精密吸取葡萄糖对照品1.0 mL、总糖样品5.0 mL和单糖样品1.0 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.3”方法操作；分别在相应波长下连续测定其吸光度值6次，通过计算得到各方法相应的RSD值。

1.2.5 稳定性试验。按照“1.2.4”方法操作后，在相应波长下，每间隔10 min测定1次，3次后每间隔30 min再测定1次，共测定7次。计算各方法相应的RSD值。

1.2.6 重复性试验。精密称取6份熟地黄5 g，按照“1.2.1.4”方法制备各供试品溶液，精密吸取各供试品溶液0.2 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.1”方法操作；精密吸取各供试品溶液0.5 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.2”方法操作；精密吸取各总糖样品5.0 mL和单糖样品1.0 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.3”方法操作；分别在相应波长下测定吸光度值，计算各方法相应的RSD值。

1.2.7 加样回收试验。称取熟地黄样品约2.5 g，共9份，精密称定，分别准确加入10、20、30 mL 0.100 8 mg/mL葡萄糖对照品，按照“1.2.1.4”方法制备各供试品溶液，再对应“1.2.3”中各方法操作后测定其吸光度值，计算回收率。

1.2.8 样品中多糖含量测定。精密称取3份熟地黄5 g，按照“1.2.1.4”方法制备各供试品溶液，精密吸取各供试品溶液0.2 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.1”方法操作；精密吸取各供试品溶液0.5 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.2”方法操作；精密吸取各总糖样品5.0 mL和单糖样品1.0 mL，分别置于具塞刻度试管中，按照“1.2.3.3”方法操作；然后分别在相应波长下测定吸光度值。利用标准曲线计算熟地黄样品的多糖含量。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的选择 由图1可见，苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法的最大吸收波长分别为489、624、510 nm。其中对于蒽酮硫酸法在419 nm处有一个较大吸收峰，通过文献[8]可知，利用蒽酮硫酸法测植物多糖其最大吸收波长为562～630 nm，故选取624 nm。

注：1为熟地黄多糖样品；2为葡萄糖对照品；3为熟地黄单糖样品。Note：1.Polysaccharide samples of Radix Rehmanniae Preparata.；2.Glucose reference substance；3.Monosaccharide samples of Radix Rehmanniae Preparata..图1 苯酚硫酸法(a)、蒽酮硫酸法(b)和DNS法(c)吸收光谱图Fig.1 Absorption spectra of phenolic-sulfuric acid method(a)，anthrone-sulfuric acid method(b)and DNS method(c)

2.2 标准曲线的绘制 根据“1.2.3”项下各个测定结果，以吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得出苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法的回归方程分别为y=107.11x-0.182 4(r=0.999 41)、y=26.71x+ 0.046(r=0.998 99)、y=7.103x+0.098(r=0.998 49)，表明3种方法分别在0.004 016～0.009 036、0.010 08～0.025 20、0.012 6～0.075 6 mg/mL，葡萄糖的质量浓度与吸光度值有良好的线性关系。

2.3 精密度试验 经计算，苯酚硫酸法对照品、供试品溶液的相应RSD值分别为0.16%、0.03%；蒽酮硫酸法对照品、供试品溶液的相应RSD值分别为0.09%、1.04%；DNS法对照品、单糖、总糖的相应RSD值分别为0.13%、0.39%、0.03%，表明仪器的精密度良好。

2.4 稳定性试验 按照“1.2.5”项下，在0、10、20、30、60、90、120 min测定吸光度值，定量计算含量后计算相应的RSD值。结果发现，苯酚硫酸法对照品、供试品溶液的相应RSD值分别为0.96%、0.69%；蒽酮硫酸法对照品、供试品溶液的相应RSD值分别为1.34%、0.64%；DNS法对照品、单糖、总糖的相应RSD值分别为0.34%、1.17%、0.48%，表明3种方法对照品和供试品溶液在2 h内稳定。

2.5 重复性试验 用3种方法平行测定6份样品的含量，计算相应的RSD值分别为：苯酚硫酸法2.29%、蒽酮硫酸法0.54%、DNS法2.12%，表明这3种方法的重复性良好。

2.6 加样回收试验 由表1～3可见，苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法的平均回收率分别为100.5%、99.8%、100.6%，RSD分别为1.6%、1.6%、1.5%，可见3种方法的回收率和RSD均较理想。

表1 苯酚硫酸法的加样回收率考察结果

表2 蒽酮硫酸法的加样回收率考察结果

表3 DNS法的加样回收率考察结果

2.7 样品中多糖含量测定 按照“1.2.8”操作，利用标准曲线计算熟地黄样品的多糖含量，得出苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、DNS法测定熟地黄样品的多糖含量分别为14.80、14.66、17.46 mg/g。

3 结论与讨论

该试验利用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法、3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)分别测定熟地黄中的多糖含量，计算得到多糖质量分数分别为14.80、14.66、17.46 mg/g；方法学考察试验结果表明，3种方法均有较好的稳定性、重复性和回收率。同时，将相同质量浓度的葡萄糖对照品用3种方法分别显色后测定其吸光度值，结果发现，苯酚硫酸法的吸光度值最大，表明3种方法中苯酚硫酸法的灵敏度最高。

该试验利用水提醇沉法提取熟地黄中的粗多糖，然后进一步利用苯酚硫酸法、蒽酮硫酸法和DNS法对其进行含量测定，在一定程度上能够排除单糖及其他水溶性成分的影响；利用DNS法测定单糖时吸光度很小，原因也很可能是在利用水提醇沉法提取多糖时，已经除去这些杂质，从而消除其影响。因此在用DNS法测熟地黄多糖时优势并不明显。

苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法测多糖含量时，试验结果接近，均能准确测定熟地黄中多糖含量。但这与崔瑛等[9]、曲丹等[10]研究的熟地黄多糖含量差异很大，可能是因为炮制方法的差异而造成的。从该试验各方面数据比较发现，采用苯酚硫酸法操作更简单易行，因此在测量熟地黄多糖含量时可优先考虑苯酚硫酸法。参考文献

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[2] 黄霞，刘杰，刘惠霞.熟地黄多糖对血虚模型小鼠的影响[J].中国中药杂志，2004，29(12)：1168-1170.

[3] 李发胜，徐恒瑰，李明阳，等.熟地多糖提取物对小鼠免疫活性影响[J].中国公共卫生，2008，24(9)：1109-1110.

[4] 苗明三，孙艳红，方晓艳.(怀)熟地黄多糖抗氧化作用[J].中国中医药信息杂志，2002，9(10)：32-33.

[5] 刘朵，章丹丹，卞卡.地黄药理药化及配伍研究[J].时珍国医国药，2012，23(3)：748-750.

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[9] 崔瑛，王晓宁，刘菊.熟地黄粗多糖提取与初步纯化工艺研究[J].时珍国医国药，2010，21(10)：2570-2571.

[10] 曲丹，王东，衣思佳，等.熟地黄总多糖含量分析[J].辽宁中医药大学学报，2008，10(5)：150-151.

Study on the Determination Methods of Polysaccharide Content ofRadixRehmanniaePreparata.

WU Shi-yun,ZHONG Yi-ning*,ZHANG Yan et al

(Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530299)

[Objective] The research aimed to establish the determination method of polysaccharide content ofRadixRehmanniaePreparata..[Method]The polysaccharide contents ofRadixRehmanniaePreparata. were determined by phenol-sulfuric acid method, anthrone-sulfuric acid method and 3,5-dinitrosalicylic acid method (DNS method) respectively, and the test results were compared.[Result]The average recovery rates of phenol-sulfuric acid method, anthrone-sulfuric acid method and DNS method were 100.5%, 99.8% and 100.6%, respectively.The RSD were 1.6%, 1.6% and 1.5% respectively.The mass fraction of polysaccharides were 14.80, 14.66 and 17.46 mg/g, respectively.[Conclusion] The phenol-sulfuric acid method was more reliable, the operation was relatively simple, which can be considered as the preferred method of determination of polysaccharide content ofRadixRehmanniaePreparata..

RadixRehmanniaePreparata.;Polysaccharide;Content determination;Phenol-sulfuric acid method;Anthrone-sulfuric acid method;3,5-dinitrosalicylic acid method

广西科技攻关计划项目(桂科攻1346008-4)；广西自然基金项目(2014GXNSFAA118271)；2014年博士研究生教育发展项目(050140002)。

吴诗云(1991- )，女，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向：中药药效物质基础。*通讯作者，副教授，博士，硕士生导师，从事中药药效物质基础研究。

2016-09-23

S 567.23+9

A

0517-6611(2016)35-0154-03