徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性

白耀博，陈学进，凤舞剑，曹 丹

(1.徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州 221151；2.河南科技学院园艺园林学院，河南新乡 453003)

徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性

白耀博1，陈学进2，凤舞剑1，曹 丹1

(1.徐州生物工程职业技术学院，江苏徐州 221151；2.河南科技学院园艺园林学院，河南新乡 453003)

[目的]明确徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性。[方法]2014、2015年在徐州不同草莓保护地采集草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)样品，经单孢分离得到93个草莓灰霉病菌菌株，采用菌丝生长速率法测定其对嘧霉胺的抗药性。[结果]检测的抗性菌株比例高达53.76%，且以低抗菌株为主，占35.48%。徐州市不同区县抗性菌株抗性频率不同，其中铜山区、贾汪区、睢宁县、沛县已出现高抗菌株。[结论]徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺已产生不同水平的抗药性，以低抗菌株为主，且抗性菌株较普遍，应合理更换或轮换使用与嘧霉胺无交互抗性的药剂。

灰霉病菌；杀菌剂；抗药性

由灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)引起的草莓灰霉病是保护地草莓上发生普遍、危害严重的病害之一，造成草莓烂果，一般减产10%～30%，重者在50%以上[1]。化学防治作为草莓病害防治的主要手段，经常使用苯并咪唑类、二甲酰亚胺类和苯胺基嘧啶类等杀菌剂。灰霉病菌因其具有寄主范围广、繁殖快和遗传变异频繁等特点，极易对杀菌剂产生抗性[2]。嘧霉胺属于苯胺基嘧啶类杀菌剂，不抑制孢子的萌发，主要抑制芽管伸长和菌丝生长，具备叶片穿透及根部内吸作用，是防治灰霉病的高效药剂[3]。已有研究表明，嘧霉胺主要抑制蛋氨酸合成和胞壁水解酶分泌[3]。灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性受单基因控制，易产生高风险的抗性问题。嘧霉胺自20世纪90代在欧洲被广泛使用以来，很多国家报道了抗性菌株的出现[4]。而我国自1998年使用嘧霉胺后，部分省市也有报道灰霉病菌的抗嘧霉胺菌株[5]。徐州市草莓灰霉病发生和危害十分严重，而嘧霉胺在当地使用多年后抗药性情况尚未明确。鉴于此，笔者于2014、2015 年在徐州市草莓主产区采集、分离草莓灰霉病菌菌株，在室内测定了其对嘧霉胺的敏感性，并测定了徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性水平，旨在为徐州市草莓种植中嘧霉胺的合理使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药剂。95.5%嘧霉胺原药由陕西农心作物科技有限公司提供。嘧霉胺原药预溶解于甲醇，配成10 mg/mL母液，保存于4 ℃冰箱中，使用时稀释成适当浓度。

1.1.2 培养基。菌株分离采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，加蒸馏水至1 000 mL。 敏感性测定采用Chapeland组合培养基[3]：葡萄糖10.0 g，琼脂15.0～20.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 5.0 g,(NH4)2SO41.0 g，加蒸馏水至1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 试验菌的采集与培养。 2014年11月至2015 年4月，在徐州周围8个区县草莓主产区调查并采集草莓灰霉病病果，用灭菌的木质牙签轻触病果上灰霉病菌霉层，迅速放入PDA培养基斜面上，带回实验室编号，注明时间地点(表1)。1个病果作为1个菌株，用 PDA分离纯化后，得到93个单孢菌株，转至 PDA 斜面上，保存于4 ℃冰箱中供抗药性测定使用。

表1 供试草莓灰霉病菌菌株及其来源

1.2.2 草莓灰霉病菌对嘧霉胺的敏感性测定。采用菌丝生长速率法[6]，将所有单孢菌株置于制备好的一系列浓度含药培养基上，检测草霉灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性。通过测定比较药剂对各菌株的抑制生长有效中浓度(EC50)，确定抗性水平。对嘧霉胺的抗药性水平由纪明山等[3]的敏感基线值(0.091 1 μg/mL)确定：菌株的EC50值小于敏感基线的5倍(0.455 5 μg/mL)为敏感菌株，当菌株的EC50值在敏感基线的5～10倍(0.455 5～0.911 0 μg/mL)为低抗菌株，当菌株的EC50值在敏感基线的10～40倍(0.911 0～3.644 0 μg/mL)为中抗菌株，当菌株的EC50值大于敏感基线的40倍(3.644 0 μg/mL)为高抗菌株。

当PDA 培养基灭菌后温度降到40 ℃左右时，加入各药剂，分别制成含嘧霉胺0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL的含药平皿。以不加药的PDA培养基为对照组，每处理3次重复。将待检测的灰霉病菌在 PDA平皿上培养3 d 后，取生长活力一致的直径5 mm 的菌片移至各含药平皿上，在25 ℃恒温培养箱培养3 d，十字交叉法测量菌落直径。应以菌丝净生长直径的差异计算各菌株在不同含药培养基上的菌丝生长抑制百分率。用DPS统计软件进行处理，求出药剂对各菌株的EC50、毒力回归方程以及相关系数，并统计各区县抗性敏感菌株的发生频率。

抗性频率=抗性菌株数/测定菌株数×100%

2 结果与分析

2.1 徐州市不同区县草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗性频率 由表2可知，徐州市的草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性比例较高，占总检测菌株的53.76%。徐州市各区县抗嘧霉胺草莓灰霉病菌株的频率和抗药性水平都存在明显差异。铜山区、贾汪区、新沂市、睢宁县草莓灰霉病菌的抗性频率较高，在60%以上； 贾汪区、睢宁县、铜山区、沛县都出现了不同水平的抗性菌株；泉山区检测到低抗菌株和中抗菌株，抗性频率达40.00%；新沂市、丰县检测到的都是低抗菌株，其抗性频率分别是66.67%、10.00%；邳州未检测到抗性菌株，均为敏感菌株。上述区县抗性频率的差异可能与不同地区的用药历史和用药水平有关。

表2 徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性

2.2 徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性 由表3可知，徐州市的草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性出现分化，抗性菌株比例达53.76%。其中，33株属于低抗菌株，占测定菌株的35.48%；8株属于中抗菌株，占测定菌株的8.60%；9株属于高抗菌株，占测定菌株的9.67%；其他43株敏感菌株占测定菌株的46.24%。抗性菌株JW14抗性水平最高，其EC50是9.083 2 μg/mL，是最敏感菌株PZ5(EC50为0.061 2 μg/mL)的148倍，说明徐州市草莓灰霉病菌已经对嘧霉胺产生不同水平的抗性，以低抗菌株为主，抗性群体较普遍。

表3 徐州市草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗性表型及频率

Table 3 Resistant phenotypes and resistance frequency ofBotrytiscinereato pyrimethanil in Xuzhou

抗性表型Resistantphenotypes测定菌株数Numberofdetectedstrains个最高EC50ThehighestEC50μg/mL最低EC50ThelowestEC50μg/mL抗性频率Resistancefrequency%高抗Highresist⁃ance99．08324．12309．67中抗Middlere⁃sistance82．80951．06508．60低抗Lowresist⁃ance330．86750．475635．48敏感Sensitivity430．42450．061246．24

3 结论与讨论

自20世纪90年代使用苯并咪唑类多菌灵、二甲酰亚胺类腐霉利以及N-苯基氨基甲酸酯类乙霉威杀菌剂防治灰霉病以来，相继有病原菌对药剂产生抗药性的报道[6]，而种植者通过增加施药次数、加大使用剂量保证生产，迫使高抗菌株成为优势种群。嘧霉胺是1998年之后在我国推广的灰霉病特效药，灰霉病菌对该类药剂的抗药性由单基因控制，因此很容易产生抗药性。近年来国内辽宁省、山东省、北京市等关于灰霉病菌对嘧霉胺等苯胺基嘧啶类杀菌剂产生抗药性的报道很多[4]，导致出现高抗菌株，严重影响田间防治效果。该研究通过对93株灰霉病菌检测结果表明，在徐州草莓主产区，草莓灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性较普遍，抗性菌株的比例高达 53.76%，抗性水平以低抗为主，并且有向中高抗水平发展的趋势，其中抗性水平最高的菌株是最敏感菌株抗性水平的148倍。江苏省苏南地区草莓灰霉病菌对嘧霉胺出现抗药性，抗性频率在60%以上[7]，这与该研究结果一致。贾汪区、睢宁县、铜山区、沛县4个区县草莓灰霉病菌对嘧霉胺已经出现高抗菌株，风险较大，值得重视。

综上可见，徐州草莓灰霉病菌已经对嘧霉胺产生了不同水平的抗药性，以低抗菌株为主，且抗性菌株较普遍。为了延长嘧霉胺的使用寿命，避免产生严重抗药性给生产带来重大损失，建议徐州市加强对嘧霉胺田间抗药性的监测工作，根据各地的实际情况，与嘧霉胺无交互抗性的药剂交替，减少每季施药量。参考文献

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[2] 乔广行，林秀敏，黄金宝，等.8种杀菌剂对番茄灰霉病菌多重抗药性菌株生物活性测定[J].农药，2013，52(1)：57-59.

[3] 纪明山，祁之秋，王英姿，等.番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性[J].植物保护学报，2003，30(4)：397-400.

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Resistance Detection ofBotrytiscinereato Pyrimethanil in Xuzhou

BAI Yao-bo1, CHEN Xue-jin2, FENG Wu-jian1et al

(1.Xuzhou Vocational College of Bioengineering, Xuzhou, Jiangsu 221151; 2.School of Horticulture Landscape Architecture, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang, Henan 453003)

[Objective] The aim was to clear resistance detection ofBotrytiscinereato pyrimethanil in Xuzhou. [Method] We collectedBotrytiscinereasamples from different strawberry protected areas in 2014 and 2015, isolated 93Botrytiscinereastrains through single spore isolation, and determined its resistance to pyrimethanil by mycelial growth rate method. [Result] The rate of resistant strains reached 53.76%, which were mainly low resistant strains, accounting for 35.48%. The resistant strains in different regions had different resistance frequency, among them Tongshan district, Jiawang district, Suining district and Peixian had high resistant strains. [Conclusion] TheBotrytiscinereain Xuzhou had generated different levels of resistance, and were mainly low resistant strains, so some regents which had no interaction resistance with pyrimethanil should be used to effectively controlBotrytiscinerea.

Botrytiscinerea; Fungicides; Resistance

徐州生物工程职业技术学院院级基金项目(2014B01)。

白耀博(1986- )，男，陕西西安人，讲师，硕士，从事保护地蔬菜病虫害防治研究。

2016-10-17

S 436.68+4

A

0517-6611(2016)35-0162-03