粉防己碱对绒癌BeWo细胞增殖和凋亡的作用

方 静，薛 艳，安瑞芳

(西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西 西安 710061)



粉防己碱对绒癌BeWo细胞增殖和凋亡的作用

方 静，薛 艳，安瑞芳

(西安交通大学第一附属医院妇产科，陕西 西安 710061)

目的 探讨粉防己碱对人绒癌BeWo细胞株增殖和凋亡的作用。方法 采用不同浓度的粉防己碱处理人绒癌BeWo细胞株，在不同的作用时间采用MTT和流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡的变化；Western blot检测PCNA和Survivin的表达。结果 采用不同剂量的粉防己碱处理BeWo细胞不同的时间，细胞均表现出生长的抑制，且为剂量及时间依赖性(P<0.01)。0、5、10、20 μg/mL粉防己碱作用24小时后，细胞凋亡的比例依次为3.52%±0.62%、8.32%±2.1%、13.45%±2.7%和27.38%±3.1 %(F=41.616，P<0.01)，PCNA蛋白表达分别为0.85±0.05、0.53±0.04、0.22±0.01和0.03±0.01(F=244.375，P<0.01)，Survivin蛋白表达分别为1.06±0.01、0.98±0.06、0.52±0.03和0.39±0.03(F=529.4，P<0.01)。结论 粉防己碱可以对绒癌细胞株BeWo产生时间及浓度依赖的生长抑制作用，诱导绒癌细胞株的凋亡，有可能成为GTT化疗方案的辅助治疗药物。

粉防己碱；绒癌；增殖；凋亡

妊娠滋养细胞疾病(gestational trophoblastic disease，GTD)是一种特殊的妊娠相关肿瘤，来源于胎盘绒毛滋养细胞，包括葡萄胎(hydatidiform mole，HM)、侵蚀性葡萄胎(invasive mole，IM)、绒毛膜癌(choriocarcinoma，CC)和胎盘部位滋养细胞肿瘤(placental site trophoblastic tumor，PSTT)等。后三者也被称为妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastic tmour，GTT)，其中CC是恶性程度最高的肿瘤，侵袭力强，早期发生血行转移，自然死亡率高达90%以上，该疾病严重威胁育龄期妇女的健康状况[1]。妊娠滋养细胞肿瘤源自于滋养细胞的异常增生，是对化疗敏感的实体瘤，侵蚀性葡萄胎和绒癌可以通过化疗治愈。但是，药物抵抗性妊娠滋养细胞肿瘤已成为妇科肿瘤专家面临的挑战。因此，创新的实验治疗方案有待于研究以突破目前治疗的难题。

粉防己碱是从中草药粉防己的块茎中提取的双苄基异喹啉类生物碱，近年来的研究显示粉防己碱可以抑制多种肿瘤细胞的增殖，并且诱导凋亡，这些肿瘤包括肝癌、膀胱癌、胃癌，肺癌，和白血病[2-5]。粉防己碱介导了参与细胞死亡及凋亡蛋白的表达和活化，包括p53、p21、Bax,、PAPR等。粉防己碱同样也被发现可以成为联合化疗，促进化疗效果的药物[6]。但是关于粉防己碱用于GTT的治疗效果目前未见报道。

本研究中采用不同浓度的粉防己碱处理人绒癌BeWo细胞株，在不同的时间检测细胞增殖及凋亡的变化，同时检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和Survivin的表达，旨在探讨粉防己碱对人绒癌BeWo细胞株增殖和凋亡的作用。

1材料与方法

1.1细胞株和试剂

人绒癌BeWo细胞株购自美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC) 细胞库。Ham/F12培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。粉防己碱购自美国Sigma公司，溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，每次使用前用培养基稀释至实验所需浓度。抗体PCNA及Survivin购自于Santa Cruz生物公司。

1.2细胞培养

人绒癌BeWo细胞株用含15%胎牛血清的Ham/F12培养基，在37℃、5%CO2的培养箱内培养，以1.25g/L 胰酶和0.2g/L 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的混合液消化传代。

1.3 噻唑蓝检测

将1×105个/孔的细胞接种于96孔培养板，24小时后更换含有不同浓度的粉防己碱(5、10、20μg/mL)的培养基。24小时后每天呈色一块96孔培养板，共进行3天。加入噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)MTT(5mg/mL)20μL，培养4小时后，移去上清，每孔加入DMSO150μL，震荡10分钟后，上酶联免疫检测仪，测定490nm处各孔光吸光度，然后用公式计算出细胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)：IR=(阴性对照A490值-实验组A490值)/阴性对照A490值×100%。

1.4细胞凋亡的检测

取BeWo细胞株常规消化，制成细胞悬液，然后以每孔1×107个细胞将处于对数生长期的BeWo细胞接种于6孔培养板，24小时后更换含有不同浓度的粉防己碱(5、10、20μg/mL)培养基，培养24小时后收集细胞，冰磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤细胞，离心加入1x结合缓冲液400μL重悬细胞，加入Annexin-V-FITC 5μL，4℃避光放置15分钟；加入PI 10μL，4℃避光放置5分钟，1小时内上流式细胞仪测定细胞的凋亡率。

1.5 Western blot检测

不同浓度的粉防己碱(5、10、20μg/mL)处理BeWo细胞株24小时，提取蛋白。12%SDS-PAGE电泳后转膜，5%牛奶室温封闭1小时，1抗孵育4℃过夜，二抗孵育1小时后采用化学荧光法显色。GAPDH用做内参。

1.6统计学方法

2结果

2.1粉防己碱对BeWo细胞株增殖的作用

BeWo细胞株用递增浓度的粉防己碱处理24小时、48小时和72小时，然后采用MTT实验检测了增殖抑制率。如图1所示，5、10、20μg/mL粉防己碱作用24小时后细胞的增值抑制率依次为17.9±0.8、20.9±1.1、27.0±1.4(F=63.118，P<0.01)，48小时依次为22.0±1.0、24.9±1.3、39.1±2.0(F=126.123，P<0.01)，72小时依次为24.9±1.2、29.0±1.3、44.9±2.7(F=129.393，P<0.01)，细胞的增殖抑制率呈现出浓度及时间依赖关系；更高的浓度的粉防己碱伴随着更高的增殖抑制率(P<0.01)。

图1 粉防己碱对BeWo细胞增殖抑制的作用

Fig.1 Effect of Tetrandrine on the proliferation inhibition of BeWo cells

2.2粉防己碱对BeWo细胞凋亡的作用

收集了不同浓度粉防己碱处理24小时的BeWo细胞，通过Annexin V-FITC/PI染色我们检测了粉防己碱处理后BeWo细胞的凋亡情况。结果显示随着粉防己碱浓度的增加，凋亡细胞的比例也增加，见图2。对照组细胞的凋亡比例为3.52%±0.62%；而相对的，由5、10、20μg/mL粉防己碱作用24小时后细胞凋亡的比例依次为8.32%±2.1%、13.45%±2.7%和27.38%±3.1%，差异具有统计学意义(F=41.616，P<0.01)，由此可见绒癌细胞株BeWo细胞凋亡数目的多少与粉防己碱的浓度密切相关。

图2 粉防己碱对BeWo细胞凋亡的作用

Fig.2 Effect of Tetrandrine on the apoptosis of BeWo cells

2.3 增殖细胞核抗原和Survivin蛋白表达的变化

采用Western blot检测了粉防己碱处理24小时后BeWo细胞株中相关蛋白的表达，见图3。不同浓度的粉防己碱处理24小时后，PCNA蛋白表达水平分别为0.85±0.05、0.53±0.04、0.22±0.01、0.03±0.01(F=244.375，P<0.01)，Survivin蛋白表达水平分别为1.06±0.07、0.98±0.06、0.52±0.03、0.39±0.03(F=529.4，P<0.01)，均明显降低。

图3 PCNA和Survivin蛋白表达的变化

Fig.3 Expression changes of PCNA and Survivin

3讨论

虽然大多数GTT患者对化疗敏感，大约90%以上的患者可以通过化疗治愈，但是临床上仍有10%的患者对化疗耐药，因此针对化疗耐药患者，探索新的二线治疗药物就显得极为重要。

3.1粉防己碱对绒癌细胞增殖和凋亡的影响

中国传统医药的临床应用历史悠久，粉防己碱(分子式C38H42N2O6)是粉防己的块茎中提取的一种生物碱，被认为是一种较为安全的药物。最近的研究发现粉防己碱具有抗肿瘤作用，其抗肿瘤的机制主要是抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡[7-8]。但是关于粉防己碱对于绒癌细胞株的作用目前尚未见报道。我们的研究结果显示粉防己碱可以抑制绒癌细胞株BeWo的增殖，并且促进细胞的凋亡，而且随着作用时间的延长及浓度的增加效果更加明显。这些关于粉防己碱诱导细胞毒性和细胞凋亡相关的数据显示随着治疗时期的延长，粉防己碱的血清水平在微摩尔范围内已经表现出用于绒毛膜癌的潜在治疗价值。

3.2粉防己碱对绒癌细胞增殖和凋亡的作用机制

为了探讨粉防己碱抑制绒癌细胞株生长及促进凋亡的机制，我们研究了与癌细胞增殖相关基因表达水平的变化。相应于癌症细胞生长的药物诱导的抑制，哺乳动物细胞常常通过激活不同的细胞增殖检查点，从而对药物诱导的肿瘤细胞生长抑制做出反应。长期以来PCNA一直被认为是直接反映细胞增殖能力的指标[9]，PCNA 在细胞的G1 期合成逐渐增加，S 期达高峰，G2 期又开始下降，其表达量与DNA 合成量变化一致，在细胞增殖周期中起着重要作用。Survivin 是凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族的成员，具有很强的抑制凋亡的作用。Cai等[10]的研究结果表明，抑制Survivin 的表达有效遏制了肿瘤细胞的生长并诱导其凋亡。本研究结果显示粉防己碱可以下调PCNA和Survivin的表达量，提示粉防己碱可能通过调控上述基因而抑制绒癌细胞株生长及促进凋亡。

综上所述，本研究表明粉防己碱在微摩尔浓度范围内可以表现出对绒癌细胞株BeWo的抗增殖活性，诱导凋亡。在这一过程中，与细胞增殖和凋亡相关联的重要调控因子PCNA和Survivin的表达量发生了下调。这些数据显示粉防己碱有望成为GTT化疗方案的辅助治疗药物，用于绒毛膜癌的治疗。

[1]Seckl M J,Sebire N J,Berkowitz R S.Gestational trophoblastic disease[J].Lancet,2010,376(9742):717-729.

[2]Li X,Xu H,Dai X,etal.Enhanced in vitro and in vivo therapeutic efficacy of codrug-loaded nanoparticles against liver cancer[J].Int J Nanomedicine,2012,7:5183-5190.

[3]Zhu R,Liu T,Tan Z,etal.Tetrandrine induces apoptosis in gallbladder carcinoma in vitro[J].Int J Clin Pharmacol Ther,2014,52(10): 900-905.

[4]Qin R,Shen H,Cao Y,etal.Tetrandrine induces mitochondria-mediated apoptosis in human gastric cancer BGC-823 cells[J].PLoS One,2013,8(10): e76486.

[5]Gao J L,Ji X,He T C,etal.Tetrandrine Suppresses Cancer Angiogenesis and Metastasis in 4T1 Tumor Bearing Mice[J].Evid Based Complement Alternat Med, 2013,2013:265061.

[6]Liu W,Zhang J,Ying C,etal.Tetrandrine combined with gemcitabine and Cisplatin for patients with advanced non-small cell lung cancer improve efficacy[J].Int J Biomed Sci,2012,8(1):28-35.

[7]Gong K,Chen C,Zhan Y,etal.Autophagy-related gene 7 (ATG7) and reactive oxygen species/extracellular signal-regulated kinase regulate tetrandrine-induced autophagy in human hepatocellular carcinoma[J].J Biol Chem,2012,287(42):35576-35588.

[8]Tao L J,Zhou X D,Shen C C,etal.Tetrandrine induces apoptosis and triggers a caspase cascade in U2-OS and MG-63 cells through the intrinsic and extrinsic pathways[J].Mol Med Rep ,2014,9(1):345-349.

[9]Li N,Deng W,Ma J,etal.Prognostic evaluation of Nanog, Oct4, Sox2, PCNA, Ki67 and E-cadherin expression in gastric cancer[J].Med Oncol,2015,32(1):433.

[10]Cai Y,Ma W,Huang X,etal.Effect of survivin on tumor growth of colorectal cancer in vivo[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(10): 13267-13272.

[专业责任编辑：杨文方]

Effects of Tetrandrine on proliferation and apoptosis of human choriocarcinoma BeWo cells

FANG Jing, XUE Yan, AN Rui-fang

(Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

Objective To study the effects of Tetrandrine on proliferation and apoptosis of human choriocarcinoma BeWo cells. Methods BeWo cells were treated with various concentrations of Tetrandrine. MTT and flow cytometry were used to detect the proliferation and apoptosis of BeWo cells at different time. Western blot was used to detect the expressions of PCNA and Survivin. Results After treatment with Tetrandrine in BeWo cells, a concentration- and time-dependent inhibition of cell growth was observed (P<0.01). After 24h treatment of 0, 5, 10 and 20μg/mL Tetrandrine, the apoptosis rate of BeWo cells was 3.52%±0.62%, 8.32%±2.1%, 13.45%±2.7% and 27.38%±3.1%, respectively (F=41.616,P<0.01), the expression of PCNA was 0.85±0.05, 0.53±0.04, 0.22±0.01, 0.03±0.01, respectively (F=244.375,P<0.01), and the expression of Survivin was 1.06±0.01, 0.98±0.06, 0.52±0.03 and 0.39±0.03, respectively (F=529.4,P<0.01).Conclusion Tetrandrine could produce concentration- and time-dependent inhibition and induce apoptosis in human choriocarcinoma BeWo cells, which may service as a cancer chemo-preventive agent for gestational trophoblastic tumor (GTT).

Tetrandrine; choriocarcinoma; proliferation; apoptosis

2016-10-19

陕西省科学技术研究发展计划国际合作项目(2013KW-27-01)；中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(XJJ2015094)

方 静(1972-)，女，副主任医师，博士，主要从事妇科肿瘤的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.12.014

R737.3

A

1673-5293(2016)12-1472-03